معلومة

ما هي البيانات التي توقعها ميسلسون وستال إذا كان تكرار الحمض النووي مشتتًا وليس شبه محافظ؟

ما هي البيانات التي توقعها ميسلسون وستال إذا كان تكرار الحمض النووي مشتتًا وليس شبه محافظ؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ما هي البيانات التي توقعها ميسلسون وستال إذا كان تكرار الحمض النووي محافظًا وليس شبه محافظ؟

إجابة:

في الجيل الأول ، سيكون هناك نطاقان ، أحدهما ذو كثافة خفيفة والآخر ذو كثافة ثقيلة. في الجيل الثاني ، لا يزال هناك نطاقان ، أحدهما ذو كثافة خفيفة والآخر ذو كثافة ثقيلة.

السؤال رقم 1:

في الجيل الثاني ، هل تقترب نطاقات الكثافة الثقيلة من نهاية أنبوب الاختبار ، ونطاقات كثافة الضوء أقرب إلى قمة الأنبوب ، من الجيل الأول؟ (بسبب العدد الأكبر من جزيئات الحمض النووي)

ما هي البيانات التي توقعها ميسلسون وستال إذا كان تكرار الحمض النووي مشتتًا وليس شبه محافظ؟

إجابة:

في الجيل الأول ، سيكون هناك نطاق واحد ، واحد ذو كثافة متوسطة. في الجيل الثاني ، لا يزال هناك نطاق واحد ، واحد ذو كثافة متوسطة.

السؤال 2:

هل العصابات أقرب إلى الجزء العلوي من أنبوب الاختبار في الجيل الثاني من الجيل الأول؟ (لأن جزيئات الحمض النووي ستصبح أخف وزنًا) إذا تمت الموافقة على هذا النموذج ، فهل يمكننا رؤية هذا التغيير في أنبوب الاختبار؟ (بين الجيلين الأول والثاني)


يجب فهم بعض الأفكار الأساسية. 1. يُفترض أن خط خلية ميسيلسون وستال في بداية التجربة يحتوي على DNA مكون بالكامل من $ N_ {15} $ النظير. 2. الحمض النووي بنسبة أكبر من $ N_ {15} $ النظير هو أكثر كثافة من الحمض النووي مع نسبة أقل من $ N_ {15} $ النظير. 3. يغوص الحمض النووي عالي الكثافة في أنبوب الاختبار أقل من الحمض النووي ذي الكثافة الأخف. (ينخفض ​​الحمض النووي بنفس الكثافة إلى نفس المستوى).

Q1: دعنا نتبع 100 خلية أصل (جيل 0). إذا كان تكاثر الحمض النووي متحفظًا ، بعد التكرار الأول (الجيل 1) ، فإننا نتوقع 200 خيط DNA. 100 ضفيرة تأتي من الخلايا "الأم" وتتكون بالكامل من $ N_ {15} $ النظير (حبلا القالب المحفوظ). الخيوط المائة الأخرى تأتي من خلايا "ابنة" وتتكون بالكامل من $ N_ {14} $ النظير (الخيط المركب حديثًا). بعد النسخ المتماثل الثاني بعد ذلك ، نتوقع 400 خيط DNA. 200 ضفيرة تأتي من خلايا "الجيل 1" وتتشارك في تكوين الحمض النووي الخاص بها: 100 خيوط من $ N_ {15} $ نظير و 100 خيوط من $ N_ {14} $ النظير. الـ 200 خصلة الأخرى تأتي من خلايا "ابنة" وتتكون بالكامل من $ N_ {14} $ النظير. وبالتالي ، في كلا الجيلين ، لا يوجد سوى شرائط DNA بنسبة 100٪ $ N_ {15} $ نظير و 100٪ $ N_ {14} $ النظير. الاختلاف الوحيد هو أن الجيل الثاني يحتوي على حمض نووي أكثر نسبيًا حبلا يتألف بالكامل $ N_ {14} $ نظير من الأول. لأن نسبة $ N_ {15} $ النظير و $ N_ {14} $ النظير في فرد تحدد الخصلة كثافة الخصلة ، ولأن الخيوط في كلا الجيلين تتكون من 100٪ $ N_ {14} $ خيوط النظائر و 100٪ $ N_ {15} $ خيوط النظائر ، العصابات المرئية في أنبوبي الاختبار على نفس المستوى. لا تتحرك بالقرب من نهايات الأنبوب.

س 2: نعم هذا صحيح. سيكون الحمض النووي للجيل الأول حوالي 50٪ $ N_ {15} $ النظير / ~ 50٪ $ N_ {14} $ خيوط النظائر. سيكون الحمض النووي للجيل الثاني 25٪ تقريبًا $ N_ {15} $ النظير / ~ 75٪ $ N_ {14} $ خيوط النظائر. خيوط أقل نسبيا $ N_ {15} $ يكون النظير أخف وبالتالي يكون أقرب إلى الجزء العلوي من أنبوب الاختبار.


ما هي البيانات التي توقعها ميسلسون وستال إذا كان تكرار الحمض النووي مشتتًا وليس شبه محافظ؟ - مادة الاحياء

ال تجربة ميسيلسون-ستال كانت تجربة قام بها ماثيو ميسلسون وفرانكلين ستال في عام 1958 والتي دعمت الفرضية القائلة بأن تكرار الحمض النووي كان شبه محافظ. في النسخ شبه المحافظ ، عندما يتم تكرار حلزون الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل ، يتكون كل من حلزوني الحمض النووي المزدوج الجديدين من خيط واحد من اللولب الأصلي وواحد تم تصنيعه حديثًا. وقد أطلق عليها "أجمل تجربة في علم الأحياء. [1]"

تم اقتراح ثلاث فرضيات مسبقًا لطريقة تكرار الحمض النووي.

في ال شبه محافظ فرضية ، اقترحها واتسون وكريك ، ينفصل خيوط جزيء الحمض النووي أثناء التكرار. ثم يعمل كل خصلة كقالب لتركيب خصلة جديدة. [2]

ال تحفظا اقترحت الفرضية أن جزيء الحمض النووي بأكمله يعمل كقالب لتركيب جزيء جديد تمامًا. وفقًا لهذا النموذج ، ترتبط بروتينات الهيستون بالحمض النووي ، وتدور الخيط وتكشف قواعد النوكليوتيدات (التي عادةً ما تبطن الجزء الداخلي) من أجل الترابط الهيدروجيني. [3]

ال مشتت تتجسد الفرضية في نموذج اقترحه ماكس ديلبروك ، والذي يحاول حل مشكلة فك خيوط اللولب المزدوج بآلية تكسر العمود الفقري للحمض النووي كل 10 نيوكليوتيدات أو نحو ذلك ، ويفك الجزيء ، ويربط الخيط القديم بـ نهاية النسخة المركبة حديثًا. هذا من شأنه أن يصنع الحمض النووي في أجزاء قصيرة بالتناوب من خيط إلى آخر. [4]

يقوم كل نموذج من هذه النماذج الثلاثة بعمل تنبؤ مختلف حول توزيع الدنا "القديم" في الجزيئات المتكونة بعد التضاعف. في الفرضية المحافظة ، بعد التكاثر ، يكون أحد الجزيئات هو الجزيء "القديم" المحفوظ بالكامل ، والآخر عبارة عن دنا مركب حديثًا. تتنبأ الفرضية شبه المحافظة بأن كل جزيء بعد النسخ المتماثل سيحتوي على خيط قديم وآخر جديد. يتنبأ النموذج المشتت أن كل خيط من كل جزيء جديد سيحتوي على مزيج من الحمض النووي القديم والجديد. [5]


ما هي البيانات التي توقعها ميسلسون وستال إذا كان تكرار الحمض النووي مشتتًا وليس شبه محافظ؟ - مادة الاحياء

تجربة Meselson - Stahl: دليل على التكرار شبه المحافظ

قام Meselson & amp Stahl أولاً بتنمية البكتيريا لعدة أجيال في وسط يحتوي فقط 15 ن (" ثقيل "النيتروجين). عند فحصه في جهاز طرد مركزي تحليلي ، الحمض النووي المعزولة من هذه البكتيريا أنتجت عصابة واحدة "ثقيلة". ثم قام Meselson & amp Stahl بنقل جزء من الثقافة إلى وسط جديد يحتوي فقط 14 ن (" ضوء النيتروجين) الحمض النووي تم عزله من هذه البكتيريا بعد جيل واحد ، فلاحظوا نطاقًا واحدًا كان "أخف" من الذي تم الحصول عليه قبل عدم ملاحظة النطاق "الثقيل" في هذه البكتيريا. متي الحمض النووي تم عزله من نفس الثقافة بعد جيلين ، لاحظوا مجموعتين متميزتين متساويتين في الشدة ، واحدة بنفس الوزن كما رأينا في التجربة السابقة ، وأخرى جديدة لا تزال "أخف". متي الحمض النووي تم عزله عن نفس الثقافة بعد ثلاثة أجيال ، وأصبحت هذه الفرقة الأخف وزنًا هي السائدة ، وتلاشت الفرقة الوسطى.

استنتج ميسلسون وأمبير ستال أن هذه التجارب أظهرت ذلك الحمض النووي كان النسخ المتماثل شبه محافظ : ال الحمض النووي تنفصل الخيوط ويصنع كل منها نسخة من نفسه ، بحيث يتكون كل جزيء من خيط واحد "قديم" وآخر "جديد". تم تصنيف البكتيريا التي تنمو في النيتروجين "الثقيل" على كلا الخيوط بالكامل بالنيتروجين "الثقيل". بعد جيل واحد في النيتروجين "الخفيف" ، كل من الحمض النووي تتكون الجزيئات من خيط واحد "ثقيل قديم" وآخر "خفيف جديد" ، ولها نفس الوزن الجزيئي "الثقيل / الخفيف" ، وهو أقل من الجزيئات "الثقيلة / الثقيلة". بعد جيلين في الوسط "الخفيف" ، يتم فصل الخيوط "الثقيلة" و "الخفيفة" ، وكلاهما يتكاثر باستخدام النيتروجين "الخفيف". وبالتالي يصبح النصف "خفيفًا / خفيفًا" ، ويصبح النصف "ثقيلًا / خفيفًا" كما في التجربة السابقة. في كل جيل متتالي ، يتم تقليل نسبة الخيوط "الثقيلة" بمقدار النصف ، ويتلاشى النطاق "الثقيل / الخفيف" تدريجيًا.

واجب منزلي :
1) هل تتوقع أن يصبح أخف خصلة شعر أخف وزناً مع الأجيال الأخرى من النسخ المتماثل؟ يشرح.

2) افترض الحمض النووي النسخ المتماثل "تحفظا”: الخيوط الأم تنفصل ، كل منها تصنع نسخة من نفسها ، وتلتقي خصلتا الابنة الجديدتان معًا كجزيء جديد وتنضم الخيوط الأم القديمة مرة أخرى. توقع نتائج تجربة Meselson - Stahl.


ميسلسون ، ستال ، وتكرار الحمض النووي: تاريخ "أجمل تجربة في علم الأحياء": هولمز ، فريدريك لورانس

هولمز ، مطبعة جامعة فريدريك لورانس ييل ، 2001 ، 503 ص. ، ISBN 0-300-08540-0 ، 40 دولارًا.

أجرى المؤلف مقابلة مع ماثيو ميسلسون وفرانكلين ستال بشكل منفصل ومجتمعًا على مدى عقد من الزمان في محاولة لإعادة بناء تاريخ "أجمل تجربة في علم الأحياء" (يُنسب هذا الاقتباس إلى جون كيرنز كما ورد في هوراس جودسون اليوم الثامن من الخلق). قام الثلاثي بفحص السجلات الموجودة ، والملاحظات من كتاب ميسيلسون ، وسجلات أجهزة الطرد المركزي ، والصور التي تحتوي على نتائج تجارب الطرد المركزي (تم نسخ العديد منها في الكتاب). قام هولمز أيضًا بفحص التقارير الدورية المكتوبة لمعهد كاليفورنيا للتكنولوجيا (Caltech) والرابطة الوطنية لشلل الأطفال ، وكانت هذه التقارير عمومًا من عمل ستال. تشمل المصادر الأخرى مناقشات مع Gunther Stent و John Cairns و James D. Watson و Howard Schachman. كمؤرخ للعلوم ، سعى هولمز للحصول على مساعدة هؤلاء الخبراء لتعلم المبادئ العلمية المعنية. تفسيراته وافية ، ومصادره مذكورة في الملاحظات التي ترافق كل فصل.

التقى ماثيو ميسيلسون وفرانكلين ستال لأول مرة في وودز هول في صيف عام 1954 عندما كانا كلاهما من طلاب الدراسات العليا. كان ميسيلسون في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا مع الأسطوري لينوس بولينج ، وكان ستال في جامعة روتشستر مع إيه إتش (جوس) دورمان. ناقش Meselson و Stahl طرق اختبار التنبؤ بالازدواج شبه المحافظ للحمض النووي على النحو الذي اقترحه Watson and Crick (لم يخترع Gunther Stent و Max Delbrück مصطلحات الأنماط المحافظة وشبه المحافظة والمشتتة للنسخ المتماثل). كانت الفكرة الأولية هي إصابة البكتيريا التي تنمو في وسط عادي بجزيئات الملتهمة المسمى الديوتيريوم والسماح بدورة واحدة من نمو العاثية. سيتم بعد ذلك الطرد المركزي للعاثية في محلول معدّل الكثافة من شأنه أن يسمح بتحليل الملتهمة الأصلية من الملتهمة المركبة حديثًا. يؤكد هولمز على الجرأة والأصالة في فكرة استخدام النظائر الثقيلة والخفيفة لحل الجزيئات المركبة حديثًا من الجزيئات الموجودة على النحو الذي اقترحه الرؤساء الشباب. تم استخدام هذه الاستراتيجية لاحقًا من قبل سيدني برينر وفرانسوا جاكوب وميسيلسون لإثبات وجود الرنا المرسال.

في عام 1956 ، انضم Stahl (الآن باحث ما بعد الدكتوراه مع جوزيبي بيرتاني) إلى Meselson في Caltech وعاشوا معًا في منزل في شارع San Pasqual في باسادينا مع Jan Drake ، الذي كان طالب دراسات عليا مع Renato Delbecco. يصف هولمز الأنشطة الاجتماعية المختلفة في هذا المنزل حيث كان السكان قادرين على العيش بشكل جيد على الرغم من إمكانياتهم المتواضعة. علمنا أن هوارد تيمين وجون كيرنز عاشا في المنزل لاحقًا.

بدأ Meselson و Stahl بـ 5-bromouracil (5BU) لإنتاج الحمض النووي الثقيل. يحل محل 5BU محل الثايمين ، وتنتج ذرة البروم نيوكليوتيد وجزيء DNA أكثر كثافة. بمساعدة جيروم فينوغراد ، فحص ميسيلسون أنماط الترسيب لعاثيات T4 ، التي نمت في الوسط مع وبدون 5BU ، في جهاز Spinco Model E للطرد المركزي (الآلة الكبيرة). لم تسر السلسلة الأولى من تجارب الطرد المركزي الفائق ، التي بدأت في ديسمبر 1956 ، بشكل جيد لمجموعة كاملة من الأسباب بما في ذلك عدم اليقين بشأن مقدار 5BU التي تم دمجها في الحمض النووي للذرية. تضمن دور ستال في المشروع تحضير عينات العاثيات ، وأجرى تحليلات شاملة لبيانات الترسيب. حدث انعطاف طويل بسبب عدم القدرة على اكتشاف جزيئات الملتهمة أو الحمض النووي بكميات وسيطة من الوالدين 5BU.

في منتصف الكتاب (ص 270) نجد الوهم الأول لتجربة ميسيلسون-ستال كما نعرفها اليوم. كتب ميسيلسون في كتابه عن الحاجة إلى التخلي عن الحمض النووي للعاثية واستخدام الحمض النووي البكتيري المزروع في وجود 15 نيوتن ، النظير الثقيل للنيتروجين مع الانتقال إلى 14 نيوتن ، النظير العادي (أكتوبر ، 1957). فجأة ، فويلا ، كان الحمض النووي قبل النقل ثقيلًا بالكامل ، أظهر الجيل الأول بعد النقل كل حمض نووي متوسط ​​الكثافة ، وأظهر الحمض النووي بعد جيلين كميات متساوية من الحمض النووي المتوسط ​​والخفيف.

كان معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا موطنًا لماكس ديلبروك ، والد أبحاث العاثيات ، وعمل ديلبروك كمرشد للمديرين. تم نقل نتائج هذه التجارب بحرية عن طريق الرسائل إلى أعضاء "مجموعة العاثيات" بما في ذلك واطسون. ومع ذلك ، فإن المدراء ماطلوا في كتابة ورقة نهائية. غير صبور ، نقل Delbrück ميسلسون وستال إلى محطة Kerkhoff البحرية في Corona del Mar وحصرهما في غرفة بالطابق العلوي مع آلة كاتبة لعدة أيام (لم يكن الأمر سيئًا كما يبدو ، ولم تكتمل المخطوطة في هذا الوقت) . من الواضح أن المديرين وغيرهم تحت وصاية Delbrück فضلوا إجراء التجارب بدلاً من الكتابة.

يقدم هولمز تحليلًا لتنظيم الورقة واستراتيجية المؤلفين والأفكار المتعلقة بالمخطوطة. مثل معظم التقارير التجريبية ، يتم تقديم ورقة Meselson-Stahl بطريقة منطقية ولا تعكس المسارات الجانبية العديدة والنهايات المسدودة للدراسة. علاوة على ذلك ، لا تذكر المقدمة هيكل Watson-Crick. ومن المفارقات أن الورقة البحثية يمكن تفسيرها كما لو كان المؤلفون يحاولون إبعاد أنفسهم عن واطسون وكريك.

تمت مقابلة ستال لشغل منصب عضو هيئة تدريس في جامعة ميسوري في أكتوبر 1957 (بينما بدأت التجارب النهائية). سيقبل Stahl منصبًا هناك في الربيع التالي ، على الرغم من أن Delbrück سيحاول الاحتفاظ به في Caltech. غادر Stahl معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا بعد حوالي 20 دقيقة من اكتمال ورقتهم البحثية (مايو 1958). أمضى ميسيلسون جزءًا من ديسمبر ويناير في الشرق والغرب الأوسط في إجازة. التقى في شيكاغو مع مجموعة من زملائه الطلاب من أيام دراسته الجامعية في جامعة شيكاغو. كان أحد زملائه هوراس جودسون ، مؤرخ البيولوجيا الجزيئية المشهور. أجرى ميسيلسون أيضًا مقابلة عمل في جامعة واشنطن في سانت لويس في قسم الأحياء الدقيقة في آرثر كورنبرغ. سرعان ما استهلك العديد من المارتيني على العشاء وأصبح مريضًا لدرجة أنه اضطر إلى الاستلقاء. لم يتلق عرض عمل.

حصل Meselson على درجة الدكتوراه. امتحان الدفاع ، برئاسة لينوس بولينج ، في مايو (1958). أخبر ريتشارد فاينمان ، عضو اللجنة الذي لم يقرأ الرسالة قبل المناقشة ، المشاركين أن هناك طريقة أسهل بكثير لحساب المسار الزمني لتوزيع الجزيئات الكبيرة في تدرج كثافة. صعد Feynman إلى السبورة واستخلص معادلاته الجديدة. بغض النظر عن الاشتقاق المرتجل المثير للإعجاب لـ Feynman ، مر ميسلسون وتلقى مكملات من Pauling بعد ذلك.

يصف الفصل قبل الأخير ، "صور تجربة" ، كيف يتم وصف هذا الاكتشاف الكلاسيكي في كتب الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية. الاستنتاجات متأصلة في تقاليد العلم لدرجة أن التجربة - ولكن ليس الاستنتاج - تم حذفها من العديد من الكتب المعاصرة ، مما يمثل خسارة للطلاب بالتأكيد. يصف الفصل الأخير ، "بعد ذلك" الوظائف الأكاديمية لميسلسون (في هارفارد) وستال (في جامعة أوريغون) ، جنبًا إلى جنب مع بعض السمات الشخصية والعائلية. في أماكن قليلة من النص ، يربط هولمز انطباعات ميسلسون وستال عن عملهما معًا. اعتقد ميسيلسون أن العمل تمت مشاركته بالكامل وشارك فيهما بشكل متساوٍ تقريبًا. شعر ستال أن ميسلسون كان المحرك الأساسي وأنه (ستال) كان ثانويًا. يعتقد هولمز أن هذا الاختلاف يعكس أنماط ومواقف وشخصيات زميلين سابقين في ماك آرثر.

بالنسبة لأولئك الذين تعلموا علومهم بعد تجربة Meselson-Stahl (الغالبية العظمى من العلماء) ، سيكون من المفاجئ معرفة الشكوك الجسيمة حول آلية النسخ شبه المحافظ التي تلقوها من أنصار مثل Max Delbrück. مصدر القلق الرئيسي هو فك خصلة واحدة عن الأخرى (أطلق ديلبروك على هذه المشكلة اسم المشكلة غير المعقدة). حلت نتيجة تجربة Meselson-Stahl إلى حد ما شكوك هؤلاء الأشخاص ، وقدمت أيضًا أدلة وحصلت على دعم من علماء آخرين لهيكل Watson-Crick وآلية النسخ شبه المحافظ.

نجح المؤلف في تحقيق الهدف المركزي للكتاب ، وهو "مقارنة البساطة الأساسية لهذه التجربة الجميلة مع الأبعاد العديدة للتعقيد التي جعلتها ممكنة". يصف الكتاب بدقة كيف يتم تحقيق العلم ، حتى العلم غير العادي. يصف هولمز شخصيات وخصوصيات العديد من المشاركين بطريقة عادلة. هذا الكتاب غني بالمعلومات ومبهج ويمكن قراءته بشكل مربح من قبل الطلاب الجامعيين والعلماء من جميع المعتقدات. يمكن بسهولة جعله جزءًا من القراءات في مسار البيولوجيا الجزيئية حيث يتم تغطية تكرار الحمض النووي ، وهو يعد بتقديم رؤية نقدية والفوز بأوسمة الطلاب ، وكثير منهم غير متحمسين للتاريخ العلمي. الأمر متروك للمعايير العالية لمجلدين هولمز عن اكتشافات هانز كريبس ، ويوصى بشدة بهذا الكتاب.


تفاعلات القارئ

تعليقات

شكرًا لك & # 8211 لا أستطيع أن أخبرك كم استمتعت بهذا الفيديو. كان الأمر كما لو كنت جالسًا في غرفة جلوس الدكتور Stahl & # 8217 ، وأجري محادثة مع هذين العالمين العظيمين. يا لها من تجربة أنيقة! لقد التقطت حقًا جوهر اثنين من العلماء المذهلين في هذا الفيديو.

شكراً لمشاركتك هذه اللقطات الرائعة لهؤلاء البشر اللامعين. يا لها من فرحة أن نراهم يتذكرون ويعلمون. لا استطيع الانتظار لعرض هذا لطلابي.


"أجمل تجربة في علم الأحياء"

اتفق المجتمع العلمي على أن هذا دليل قوي في دعم النموذج شبه المحافظ. أطلق عليها جون كيرنز ، أحد علماء الأحياء الجزيئية الرائدين في ذلك العصر ، "أجمل تجربة في علم الأحياء". حتى يومنا هذا ، يتم تدريس تجربة Meselson و Stahl في جميع أنحاء العالم كمثال كلاسيكي على الطريقة العلمية الحديثة للتجريب. بتصميم واحد بسيط ، تم اختبار ثلاث فرضيات علمية من خلال المراقبة / التحقق من تنبؤاتها.

لدى العلماء الآن فهم مفصل للأحداث الجزيئية لتكرار الحمض النووي (انظر نموذجنا الخاص ببنية الحمض النووي ، وتحقق من أن النموذج شبه المحافظ لتكرار الحمض النووي صحيح بالفعل. لا تزال تقنية Meselson و Stahl لتسمية خيوط الحمض النووي بنظائر النيتروجين يستخدمها العلماء في جميع أنحاء العالم وهم يواصلون استكشاف ألغاز وتعقيدات الحمض النووي ، المادة الوراثية للحياة.

ملخص

يعد اختبار التنبؤات جزءًا رئيسيًا من البحث العلمي ، ومكونًا رئيسيًا للعديد من التجارب الكلاسيكية. تستكشف هذه الوحدة طرق البحث التي استخدمها Meselson و Stahl في تجربتهما البارعة لعام 1958 التي توضح كيف يتكاثر الحمض النووي. تسلط الوحدة الضوء على قوة البساطة فيما يسمى "أجمل تجربة في علم الأحياء".


68 أساسيات استنساخ الحمض النووي

بنهاية هذا القسم ، ستكون قادرًا على القيام بما يلي:

  • اشرح كيف تكشف بنية الحمض النووي عن عملية النسخ
  • وصف تجارب ميسيلسون وستال

قدم توضيح بنية اللولب المزدوج تلميحًا حول كيفية تقسيم الحمض النووي وعمل نسخ منه. في بحثهما لعام 1953 ، صاغ واتسون وكريك تقويضًا لا يُصدق: & # 8220 لم يفلت من ملاحظة أن الاقتران المحدد الذي افترضناه على الفور يشير إلى آلية نسخ محتملة للمادة الجينية. & # 8221 مع أزواج أساسية محددة ، تسلسل يمكن توقع خيط DNA واحد من مكمله. يقترح نموذج اللولب المزدوج أن خيطي اللولب المزدوج منفصلان أثناء النسخ المتماثل ، ويعمل كل خيط كقالب يُنسخ منه الشريط التكميلي الجديد. ما لم يكن واضحًا هو كيفية حدوث النسخ المتماثل. تم اقتراح ثلاثة نماذج ((الشكل)): محافظة وشبه محافظة ومشتتة.


في التكرار المحافظ ، يبقى الحمض النووي الأبوي معًا ، وتكون خيوط الابنة المشكلة حديثًا معًا. تقترح الطريقة شبه المحافظة أن كل من خيطي DNA الأبوين يعملان كقالب للحمض النووي الجديد ليتم تصنيعه بعد النسخ المتماثل ، كل DNA مزدوج الشريطة يشتمل على خيط أبوي واحد أو خيط "قديم" وحبل واحد "جديد". في النموذج المشتت ، تحتوي كلتا نسختين من الحمض النووي على أجزاء مزدوجة تقطعت بها السبل من الحمض النووي الأبوي والحمض النووي المركب حديثًا.

كان Meselson و Stahl مهتمين بفهم كيفية تكرار الحمض النووي. لقد نموا بكتريا قولونية لعدة أجيال في وسط يحتوي على نظير "ثقيل" من النيتروجين (15 نيوتن) ، والذي يتم دمجه في القواعد النيتروجينية ، وفي النهاية في الحمض النووي ((الشكل)).


ال بكتريا قولونية ثم تم وضع المزرعة في وسط يحتوي على 14 نيوتن وسمح لها بالنمو لعدة أجيال. بعد كل جيل من الأجيال القليلة الأولى ، تم حصاد الخلايا وعزل الحمض النووي ، ثم طرده بسرعات عالية في جهاز طرد مركزي فائق. أثناء الطرد المركزي ، تم تحميل الحمض النووي في ملف الانحدار (عادة محلول ملح مثل كلوريد السيزيوم أو السكروز) ويتم غزله بسرعات عالية تتراوح من 50،000 إلى 60،000 دورة في الدقيقة. في ظل هذه الظروف ، سيشكل الحمض النووي عصابة وفقًا له كثافة الطفو: الكثافة داخل التدرج الذي يطفو عنده. سيشكل الحمض النووي الذي ينمو في 15 نيوتن نطاقًا عند موضع كثافة أعلى (أي أبعد أسفل أنبوب الطرد المركزي) من ذلك الذي نما في 14 ن. N ، كان النطاق الفردي الذي تمت ملاحظته وسيطًا في الموضع بين الحمض النووي للخلايا التي نمت حصريًا في 15 N و 14 N. وهذا يشير إما إلى وضع النسخ المتماثل شبه المحافظ أو التشتيت. شكل الحمض النووي المأخوذ من الخلايا التي نمت على مدى جيلين في 14 نيوتن شريطين: شريط واحد للحمض النووي كان في الموضع المتوسط ​​بين 15 نيوتن و 14 نيوتن ، والآخر يتوافق مع نطاق 14 نيوتن. لا يمكن تفسير هذه النتائج إلا إذا تكرر الحمض النووي بطريقة شبه محافظة. ولهذا السبب ، تم استبعاد النموذجين الآخرين.

أثناء تكرار الحمض النووي ، يعمل كل من الخيطين اللذين يشكلان الحلزون المزدوج كقالب تُنسخ منه خيوط جديدة. سوف تكون الخيوط الجديدة مكملة للخيوط الأبوية أو "القديمة". عندما يتم تكوين نسختين من الحمض النووي للابنتين ، يكون لهما نفس التسلسل وينقسمان بالتساوي إلى خليتين ابنتيتين.

انقر خلال هذا البرنامج التعليمي على تكرار الحمض النووي.

ملخص القسم

أثناء انقسام الخلية ، تتلقى كل خلية ابنة نسخة من كل جزيء من الحمض النووي من خلال عملية تعرف باسم تكرار الحمض النووي. يتكون الكروموسوم الفردي من بدائيات النوى أو كل كروموسوم من حقيقيات النوى من حلزون مزدوج واحد مستمر. يشير نموذج تكرار الحمض النووي إلى أن خيطي اللولب المزدوج ينفصلان أثناء التكرار ، ويعمل كل خيط كقالب يتم نسخ الخيط التكميلي الجديد منه. في النموذج المحافظ للنسخ المتماثل ، يتم حفظ الحمض النووي للوالدين ، ويتم تصنيع الحمض النووي للابنة حديثًا. يقترح النموذج شبه المحافظ أن كل من خيطي DNA الوالدين يعملان كقالب للحمض النووي الجديد ليتم تصنيعه بعد النسخ المتماثل ، حيث يحتفظ كل DNA مزدوج الشريطة بالضفيرة الأبوية أو "القديمة" وخيط واحد "جديد". اقترح النموذج المشتت أن نسختين من الحمض النووي ستحتويان على أجزاء من الحمض النووي الأبوي والحمض النووي المركب حديثًا. دعمت تجربة Meselson و Stahl النموذج شبه المحافظ للنسخ المتماثل ، حيث يتكون الكروموسوم المكرر بالكامل من خيط أبوي واحد وخيط واحد من الحمض النووي المركب حديثًا.

راجع الأسئلة

أثبتت تجارب Meselson و Stahl & # 8217 أن الحمض النووي يتكاثر بأي وضع؟

إذا كان تسلسل الخيط 5 & # 8242-3 & # 8242 هو AATGCTAC ، فإن التسلسل التكميلي يحتوي على التسلسل التالي:

كيف دعم ميسلسون وستال نموذج الحلزون المزدوج لواتسون وكريك؟

  1. لقد أظهروا أن كل خيط يعمل كنموذج لتركيب خيط جديد من الحمض النووي.
  2. لقد أظهروا أن خيوط الحمض النووي تتكسر وتتحد دون أن تفقد المادة الجينية.
  3. لقد أثبتوا أن الحمض النووي يحافظ على بنية الحلزون المزدوج أثناء خضوعه لتكرار شبه محافظ.
  4. لقد أظهروا أن النسخ المحافظ يحافظ على الاقتران الأساسي التكميلي لكل حلزون DNA.

أسئلة التفكير النقدي

كيف علم المجتمع العلمي أن تكرار الحمض النووي يحدث بطريقة شبه محافظة؟

تجارب ميسيلسون مع بكتريا قولونية نمت في 15 نيوتن استنتج هذه النتيجة.

تخيل أن تجارب ميسلسون وستال قد دعمت التكرار المحافظ بدلاً من التكرار شبه المحافظ. ما النتائج التي تتوقع ملاحظتها بعد جولتين من النسخ المتماثل؟ كن محددًا فيما يتعلق بتوزيعات الحمض النووي التي تتضمن 15 نيوتن و 14 نيوتن في التدرج.

بعد جولتين من النسخ المحافظ ، سيتم الكشف عن نطاقتين بعد التنبيذ الفائق. سيكون النطاق السفلي (الأثقل) عند كثافة 15 نيوتن ، وسيشكل 25 ٪ من إجمالي الحمض النووي. سيكون النطاق الثاني ، الأعلى (الأخف) عند كثافة 14 نيوتن ، وسيحتوي على 75 ٪ من إجمالي الحمض النووي.


علم الأحياء 171

بنهاية هذا القسم ، ستكون قادرًا على القيام بما يلي:

  • اشرح كيف تكشف بنية الحمض النووي عن عملية النسخ
  • وصف تجارب ميسيلسون وستال

قدم توضيح بنية اللولب المزدوج تلميحًا حول كيفية تقسيم الحمض النووي وعمل نسخ منه. في بحثهما لعام 1953 ، صاغ واتسون وكريك مبالغة لا تصدق: & # 8220 لم يفلت من ملاحظة أن الاقتران المحدد الذي افترضناه على الفور يشير إلى آلية نسخ محتملة للمادة الجينية. & # 8221 مع أزواج أساسية محددة ، تسلسل يمكن توقع خيط DNA واحد من مكمله. يقترح نموذج اللولب المزدوج أن خيطي اللولب المزدوج منفصلان أثناء النسخ المتماثل ، ويعمل كل خيط كقالب يُنسخ منه الشريط التكميلي الجديد. ما لم يكن واضحًا هو كيفية حدوث النسخ المتماثل. تم اقتراح ثلاثة نماذج ((الشكل)): محافظة وشبه محافظة ومشتتة.


في التكرار المحافظ ، يبقى الحمض النووي الأبوي معًا ، وتكون خيوط الابنة المشكلة حديثًا معًا. تقترح الطريقة شبه المحافظة أن كل من خيطي DNA الأبوين يعملان كقالب للحمض النووي الجديد ليتم تصنيعه بعد النسخ المتماثل ، كل DNA مزدوج الشريطة يشتمل على خيط أبوي واحد أو خيط "قديم" وحبل واحد "جديد". في النموذج المشتت ، تحتوي كلتا نسختين من الحمض النووي على أجزاء مزدوجة تقطعت بها السبل من الحمض النووي الأبوي والحمض النووي المركب حديثًا.

كان Meselson و Stahl مهتمين بفهم كيفية تكرار الحمض النووي. لقد نموا بكتريا قولونية لعدة أجيال في وسط يحتوي على نظير "ثقيل" من النيتروجين (15 نيوتن) ، والذي يتم دمجه في القواعد النيتروجينية ، وفي النهاية في الحمض النووي ((الشكل)).


ال بكتريا قولونية ثم تم وضع المزرعة في وسط يحتوي على 14 نيوتن وسمح لها بالنمو لعدة أجيال. بعد كل جيل من الأجيال القليلة الأولى ، تم حصاد الخلايا وعزل الحمض النووي ، ثم طرده بسرعات عالية في جهاز طرد مركزي فائق. أثناء الطرد المركزي ، تم تحميل الحمض النووي في ملف الانحدار (عادة محلول ملح مثل كلوريد السيزيوم أو السكروز) ويتم غزله بسرعات عالية تتراوح من 50،000 إلى 60،000 دورة في الدقيقة. في ظل هذه الظروف ، سيشكل الحمض النووي عصابة وفقًا له كثافة الطفو: الكثافة داخل التدرج الذي يطفو عنده. سيشكل الحمض النووي الذي ينمو في 15 نيوتن نطاقًا عند موضع كثافة أعلى (أي أبعد أسفل أنبوب الطرد المركزي) من ذلك الذي نما في 14 ن. N ، كان النطاق الفردي الذي تمت ملاحظته وسيطًا في الموضع بين الحمض النووي للخلايا التي نمت حصريًا في 15 N و 14 N. وهذا يشير إما إلى وضع النسخ المتماثل شبه المحافظ أو التشتيت. شكل الحمض النووي المأخوذ من الخلايا التي نمت على مدى جيلين في 14 نيوتن شريطين: شريط واحد للحمض النووي كان في الموضع المتوسط ​​بين 15 نيوتن و 14 نيوتن ، والآخر يتوافق مع نطاق 14 نيوتن. لا يمكن تفسير هذه النتائج إلا إذا تكرر الحمض النووي بطريقة شبه محافظة. ولهذا السبب ، تم استبعاد النموذجين الآخرين.

أثناء تكرار الحمض النووي ، يعمل كل من الخيطين اللذين يشكلان الحلزون المزدوج كقالب تُنسخ منه خيوط جديدة. سوف تكون الخيوط الجديدة مكملة للخيوط الأبوية أو "القديمة". عندما يتم تكوين نسختين من ابنتيهما ، يكون لهما نفس التسلسل وينقسمان بالتساوي إلى خليتين ابنتيتين.

انقر عبر نسخ الحمض النووي (فلاش للرسوم المتحركة).

ملخص القسم

أثناء انقسام الخلية ، تتلقى كل خلية ابنة نسخة من كل جزيء من الحمض النووي من خلال عملية تعرف باسم تكرار الحمض النووي. يتكون الكروموسوم الفردي من بدائيات النوى أو كل كروموسوم من حقيقيات النوى من حلزون مزدوج واحد مستمر. يشير نموذج تكرار الحمض النووي إلى أن خيطي اللولب المزدوج ينفصلان أثناء التكرار ، ويعمل كل خيط كقالب يتم نسخ الخيط التكميلي الجديد منه. في النموذج المحافظ للنسخ المتماثل ، يتم حفظ الحمض النووي للوالدين ، ويتم تصنيع الحمض النووي للابنة حديثًا. يقترح النموذج شبه المحافظ أن كل من خيطي DNA الوالدين يعملان كقالب للحمض النووي الجديد ليتم تصنيعه بعد النسخ المتماثل ، حيث يحتفظ كل DNA مزدوج الشريطة بالضفيرة الأبوية أو "القديمة" وخيط واحد "جديد". اقترح النموذج المشتت أن نسختين من الحمض النووي ستحتويان على أجزاء من الحمض النووي الأبوي والحمض النووي المركب حديثًا. دعمت تجربة Meselson و Stahl النموذج شبه المحافظ للتكرار ، حيث يتكون الكروموسوم المكرر بالكامل من خيط أبوي واحد وخيط واحد من الحمض النووي المركب حديثًا.

إستجابة مجانية

كيف علم المجتمع العلمي أن تكرار الحمض النووي يحدث بطريقة شبه محافظة؟

تجارب ميسيلسون مع بكتريا قولونية نمت في 15 نيوتن استنتج هذه النتيجة.

تخيل أن تجارب ميسلسون وستال قد دعمت التكرار المحافظ بدلاً من التكرار شبه المحافظ. ما النتائج التي تتوقع ملاحظتها بعد جولتين من النسخ المتماثل؟ كن محددًا فيما يتعلق بتوزيعات الحمض النووي التي تتضمن 15 نيوتن و 14 نيوتن في التدرج.

بعد جولتين من النسخ المحافظ ، سيتم الكشف عن نطاقتين بعد التنبيذ الفائق. سيكون النطاق السفلي (الأثقل) عند كثافة 15 نيوتن ، وسيشكل 25 ٪ من إجمالي الحمض النووي. سيكون النطاق الثاني ، الأعلى (الأخف) بكثافة 14 نيوتن ، وسيحتوي على 75 ٪ من إجمالي الحمض النووي.


إنبات فكرة: ميسلسون يلتقي ستال

بدأ مات ميسلسون دراسته العليا في الكيمياء في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا (Caltech ، باسادينا ، كاليفورنيا) في عام 1953. التحق بمختبر Linus Pauling وأكمل في النهاية الجزء الثاني من الدكتوراه. أطروحة (9) في الهيكل البلوري لـ N ، N ′ثنائي ميثيل مالوناميد، لتحديد ما إذا كانت مجموعات الببتيد الموجودة في هذا الجزيء مستوية ، وبالتالي وفقًا لنظرية الرنين لبولينج. هذا الفصل من أطروحته أقل شهرة من الجزء الأول الذي كان بعنوان ترسيب التوازن للجزيئات الكبيرة في تدرجات الكثافة مع التطبيق على دراسة الحمض النووي. كطالب في دورة بولينج حول الرابطة الكيميائية ، أصبح مات مهتمًا بالقوة النسبية للروابط الهيدروجينية عندما تم استبدال الهيدروجين الطبيعي بالنظير الثقيل ، الديوتيريوم. أثناء تطوير اهتمامه بكيفية نجاح الكائنات الحية إذا قامت بدمج الديوتيريوم في جزيئاتها ، صادف ميسلسون حضور ندوة في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا من قبل جاك مونود ، الذي أثار مسألة ما إذا كانت ظاهرة تخليق الإنزيم المستحث ، التي لم يتم فهمها جيدًا في ذلك الوقت ، تنطوي حقًا على جديد. تخليق البروتين. تكهن ميسيلسون أنه إذا أمكن نمو البكتيريا في ماء الديوتيريوم (الثقيل) ، ثم نقلها إلى الماء العادي في نفس اللحظة التي تمت فيها إضافة "محفز" ، فإن أي بروتينات جديدة يجب أن تكون ذات كثافة "طبيعية" وفرق الكثافة بين " قد تسمح البروتينات القديمة "و" الجديدة "بفصلها. في الواقع ، إذا قام أحدهم بالطرد المركزي للبروتينات في محلول متوسط ​​الكثافة ، فإن البروتين "القديم" قد يغرق بينما يجب أن يطفو البروتين المركب حديثًا. في وقت لاحق من ذلك العام ، وجه انتباهه إلى مشكلة تكرار الحمض النووي ، بعد مناقشة حية مع ماكس ديلبروك حول الحلزون المزدوج Watson-Crick والأنماط المحتملة لتكرارها. خطر ببال مات أن نفس النهج الذي تصوره لتخليق البروتين يمكن أيضًا تطبيقه لدراسة تكرار الحمض النووي. قرر في تلك المرحلة أنه يريد تكريس طاقاته لتحديد ما إذا كان الحمض النووي ، بالفعل ، يتكرر بالطريقة التي تنبأ بها واتسون وكريك. لا علاقة له بهذا الهدف ، فقد أمضى صيف عام 1954 في المختبر البيولوجي البحري في وودز هول ، ماساتشوستس ، لمساعدة جيم واتسون في بعض تجارب المعايرة التي تم تصميمها لتوفير دعم محتمل لهيكل حلزوني مزدوج من الحمض النووي الريبي ، مشابهًا لبنية الحمض النووي الريبي. الحمض النووي. كان فرانك ستال ، الذي كان وقتها طالب دراسات عليا في علم الأحياء من جامعة روتشستر (روتشستر ، نيويورك) ، أيضًا في وودز هول في الصيف لأخذ دورة في علم وظائف الأعضاء. التقيا بينما كان فرانك جالسًا تحت شجرة يعمل على مشكلة في علم الوراثة العاثية. الشكل 1 عبارة عن صورة لمات وفرانك بعد 42 عامًا ، وهما يقفان في نفس المكان. في حين كان مات لا يزال ساذجًا تمامًا بشأن علم الوراثة العاثية ، كان يمتلك المهارات في حساب التفاضل والتكامل لمساعدة فرانك في حل المشكلة. عندما أصبحوا على دراية ، أثار مات لاحقًا إمكانية عملهم بالتعاون في حل مشكلة تكرار الحمض النووي - باستخدام DNA phage ، للاستفادة من خبرة Stahl. واقترح أيضًا استخدام الديوتيريوم كعلامة ثقيلة في تجربة نمو من خطوة واحدة (عن طريق القياس بأفكاره السابقة حول بروتينات وسم الكثافة) ، ثم طرد العينة في محلول ذي كثافة مناسبة لفصل الحمض النووي "الخفيف" في الجزء العلوي من الأنبوب من الحمض النووي "الثقيل" في الجزء السفلي. ومع ذلك ، سرعان ما أدرك كلاهما المشكلة المعقدة المتمثلة في إجراء تجربة النسخ المتماثل مع الملتهمة ، بسبب إعادة التركيب المكثف المعروف حدوثه ، والذي قد يُتوقع منه إعادة خلط الحمض النووي للوالدين والابنة ، وبالتالي الخلط بين التحليل. لحسن الحظ ، كان ستال يخطط بالفعل للذهاب إلى معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا من أجل حصوله على الدكتوراه ، حتى يتمكنوا من مواصلة مناقشتهم والعمل معًا هناك ، ربما لتطوير استراتيجيتهم باستخدام نظام خلوي "بسيط" ، وهو البكتيريا الإشريكية القولونية.

التقطت الصورة ف. إل هولمز من مات ميسيلسون وفرانك ستال في عام 1996 ، وهما يقفان في الموقع الذي التقيا فيه في وودز هول قبل 42 عامًا (الشكل 14.1 في المرجع 2). بإذن من عائلة هولمز.

أراد مات معرفة المزيد عن الطبيعة الكيميائية لسلائف المونومر للحمض النووي ، وفي سياق هذا البحث الأدبي ، تعلم عن 5-بروموراسيل (5BU) ، وهو نظير من الثايمين ، والذي يمكن للبكتيريا أن تدمجها أثناء تخليق الحمض النووي بدلاً من الثايمين. 5BU مكافئ للثيمين فيما عدا أن البروم يتم استبداله بمجموعة الميثيل في الموضع C5: يحتوي البروم بشكل ملائم تقريبًا على نفس نصف قطر van der Waals مثل مجموعة الميثيل. نظرًا لاختلاف درجة التأين بين 5BU والثايمين ، اعتبر مات أنه قد يكون قادرًا على فصل الجزيئات التي تحمل علامة 5BU عن تلك التي تحتوي على الثايمين عن طريق الرحلان الكهربي. However, more importantly, he appreciated the fact that 5BU would make the DNA containing it significantly heavier than normal thymine-containing DNA. He then considered using 5BU as a density label for DNA to follow its replication by the scheme considered earlier.

Matt became acquainted with Jerry Vinograd, who was the ultracentrifugation “guru” at Caltech, and he learned to operate the state-of-the-art Beckman Spinco Model E analytical ultracentrifuge ( Fig. 2). With Vinograd's initial tutelage, Matt tried sedimentation of DNA in a 7-molal solution of the heavy salt, CsCl—his idea was still that an experiment could be performed with a density label and that “light” DNA should float and that the density-labeled heavy DNA would sink in a solvent of the appropriate density. However, they were both amazed at how rapidly a salt gradient formed during the high-speed centrifugation and, furthermore, that the DNA migrated to a narrow band within the gradient. The band formed at the position of the buoyant density of the DNA in that stable salt gradient.

Photographs of Jerome Vinograd and Matt Meselson. (أ) Jerome Vinograd by “his” Spinco Model E analytical ultracentrifuge, serial no. 186. (Courtesy of the Caltech Archives.) (ب) Matt Meselson at the controls for the UV optics and photography system of Model E no. 186 used for the classic experiment. (Courtesy of the Caltech Archives.)

The concept of equilibrium sedimentation in density gradients generated during the approach to equilibrium of a low molecular weight solute (e.g., CsCl) was elaborated by Meselson وآخرون. ( 10) in a paper communicated to PNAS by Linus Pauling in May 1957. The figures in that paper and the theoretical calculations are essentially part I of Meselson's Ph.D. thesis, which, interestingly, provides no preview of the intent to apply density labeling to the study of DNA replication. The paper focuses instead on the nature of the band structure and the fact that the concentration distribution of a single macromolecular species in a constant density gradient should be Gaussian, and that the standard deviation of that band is then inversely proportional to the square root of the macromolecular weight. The model was remarkably correct, as tested with homogeneous DNA of known molecular weight from bacteriophage T4. This paper also documents the first analysis of the density distribution of DNA containing 5BU, obtained from T4-infected cultures of بكتريا قولونية grown in media with this thymine analog. The 5BU fully substituted DNA molecules banded at a density of 1.8 g/cm 2 , whereas those of normal thymine-containing T4 bacteriophage DNA were well separated from these at 1.7 g/cm 2 . Although there was no mention of using this approach to study DNA replication, the application to study intact viruses and smaller molecules like proteins is discussed in this pioneering report on density gradient sedimentation.


RNA and protein

While DNA is the genetic material for the vast majority of organisms, there are some viruses that use RNA كمادة وراثية. These viruses can be either single or double stranded and include SARS, influenza, hepatitis C and polio, as well as the retroviruses like HIV-AIDS. Typically there is DNA used at some stage in their life cycle to replicate their RNA genome.

Also, the case of Prion infections agents transmit characteristics via only a protein (no nucleic acid present). Prions infect by transmitting a misfolded protein state from one aberrant protein molecule to a normally folded molecule. These agents are responsible for bovine spongiform encephalopathy (BSE, also known as "mad cow disease") in cattle and deer and Creutzfeldt&ndashJakob disease (CJD) in humans. All known prion diseases act by altering the structure of the brain or other neural tissue and all are currently untreatable and ultimately fatal.


شاهد الفيديو: تركيب حمض DNA (قد 2022).


تعليقات:

  1. Dorren

    لدي موقف مشابه. دعوة المنتدى.

  2. Sewall

    أعتذر ولكن في رأيي أنت تعترف بالخطأ. أعرض مناقشته. اكتب لي في PM ، سنتعامل معها.

  3. Yuli

    اسمي إيفلينا. في الصباح ، جالسًا في العمل ، قرأت كل شيء هنا. ثم قررت الكتابة أيضًا. هناك ثلاث دقائق قبل الذهاب إلى المنزل. بطريقة ما تفعل ذلك بطريقة غريبة. منذ البداية ، تكون الموضوعات مفهومة نوعًا ما ، في الوسط متوسط. لكن الجدد ، يحصل المرء على انطباع بأنه لا يكتب بالفعل.

  4. Khalfani

    شيء ما لا يعمل مثل هذا

  5. Vudoshicage

    أنا آسف ، لكن في رأيي ، هناك أخطاء. نحن بحاجة إلى مناقشة. اكتب لي في PM.

  6. Lear

    برافو ، فكرتك أنها رائعة

  7. Mooguzahn

    أعتقد أنك مخطئ. يمكنني إثبات ذلك. اكتب لي في PM ، وسوف نتعامل معها.



اكتب رسالة