معلومة

كيف البكتيريا المنتجة للبكتيريا تحمي نفسها منها؟

كيف البكتيريا المنتجة للبكتيريا تحمي نفسها منها؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

عندما يكون هناك كول بلازميد في البكتيريا ، فإنه ينتج البكتيريا التي تقتل البكتيريا الأخرى من حولها. لماذا لا تقتل البكتريوسين البكتيريا التي أنتجتها؟ كيف يساعد كول بلازميد أيضًا في حماية البكتيريا من البكتيريا الخاصة بها؟


الأنشطة المضادة للبكتيريا للبكتريوسينات: التطبيق في الأطعمة والمستحضرات الصيدلانية


شيه تشون يانغ 1،2 & # x02020 ، تشيه هونغ لين 3،4 & # x02020 ، كالفين تي سونغ 5 و جيا يو فانغ 1،2،6 *
  • 1 مركز أبحاث صناعة الإيكولوجيا البشرية ، جامعة تشانغ غونغ للعلوم والتكنولوجيا ، تاويوان ، تايوان
  • 2 معمل الصيدلانيات ، المعهد العالي للمنتجات الطبيعية ، جامعة تشانغ غونغ ، تاويوان ، تايوان
  • 3 مركز التعليم العام ، جامعة تشانغ جونج للعلوم والتكنولوجيا ، تاويوان ، تايوان
  • 4 مركز أبحاث الأمراض المزمنة وتعزيز الصحة ، جامعة تشانغ غونغ للعلوم والتكنولوجيا ، تاويوان ، تايوان
  • 5 قسم الأحياء الدقيقة والمناعة وعلم الوراثة الجزيئية ، جامعة كاليفورنيا ، لوس أنجلوس ، لوس أنجلوس ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية
  • 6 فريق أبحاث طب الأعشاب الصيني ، مركز أبحاث الشيخوخة الصحية ، جامعة تشانغ غونغ ، تاويوان ، تايوان

البكتريوسينات هي نوع من الببتيدات الريبوزومية المركبة المضادة للميكروبات التي تنتجها البكتيريا ، والتي يمكن أن تقتل أو تمنع السلالات البكتيرية وثيقة الصلة أو غير المرتبطة بالبكتيريا المنتجة ، ولكنها لن تضر البكتيريا نفسها عن طريق بروتينات مناعة معينة. تصبح البكتريوسينات أحد الأسلحة ضد الكائنات الحية الدقيقة بسبب الخصائص المحددة للتنوع الكبير في البنية والوظيفة ، والموارد الطبيعية ، وكونها مستقرة للتسخين. قامت العديد من الدراسات الحديثة بتنقية وتحديد البكتريوسينات للتطبيق في تكنولوجيا الغذاء ، والتي تهدف إلى إطالة وقت حفظ الطعام ، وعلاج الأمراض المسببة للأمراض وعلاج السرطان ، والحفاظ على صحة الإنسان. لذلك ، قد تصبح البكتريوسينات مرشحًا محتملًا للأدوية لتحل محل المضادات الحيوية من أجل علاج العديد من مسببات الأمراض المقاومة للأدوية في المستقبل. تلخص مقالة المراجعة هذه الأنواع المختلفة من البكتريوسينات من البكتيريا. يركز النصف الأخير من هذه المراجعة على التطبيقات المحتملة في علوم الأغذية وصناعة الأدوية.


Lactococcus lactis LMG2081 ينتج نوعين من البكتيريا ، أحد المضادات الحيوية غير المضادات الحيوية ومضاد حيوي جديد

الشكل 1 تحليل نشاط بكتيريوسين من L. lactis LMG2081 وطفراته. (أ) LMG2081 مقابل BGMN1-596. (ب) LMG2081 ضد BGBM50 (منتج لاكتوكوكسين جي). (C) LMG2081 / pG + host9lcnG (ΔlcnG) مقابل BGMN1-596. (D) LMG2081 / pG + host9lctLMG (ΔlcnLMG) ضد BGBM50. (E) LMG2081 / pG + host9lctLMG مقابل BGMN1-596. الشكل 2 خريطة الجينات الخطية للمنطقة تحمل 8000 نقطة أساس lctLMG أوبرون في L. lactis LMG2981. يشار إلى مواقف مواقع التقييد ذات الصلة. الأسهم وحجم واتجاه ORFs المتوقعة. الشكل 3 محاذاة تسلسل الببتيد المستنتج لـ lacticin LMG والمضادات الحيوية المتماثلة من النوع A (II) ، بما في ذلك nukacin ISK-1 من Staphylococcus warneri (GenBank accession no. Q9KWM4) ، اللاكتيسين 481 من Lactococcus lactis (GenBank accession no. من Kocuria varians (GenBank accession no. CAA63706) ، butyrivibriocin OR79 من Butyrivibrio fibrisolvens (GenBank accession no. AAC19355) ، lacticin LmgA من Lactococcus lactis (GenBank accession no. CUH82811.1) ، و salivaricin no. AFB74480). أحماض أمينية مسطرة ، ببتيد زعيم X ، بقايا غير محددة. يشير التظليل الرمادي والعلامات النجمية إلى أحماض أمينية متطابقة ، وتشير الفترات إلى أحماض أمينية تنتمي إلى مجموعات مماثلة ، وتشير النقطتين إلى أحماض أمينية تنتمي إلى نفس المجموعة.

بناء سلالات متحولة.

توطين أوبرون Lacticin LMG.

الشكل 4 لمحات PFGE من Lactococcus lactis LMG2081 و lacticin LMG و lactococcin G mutants (A) وتهجين اللطخة الجنوبية مع lmgM مسبار (ب). إجمالي الحمض النووي من Lactococcus lactis LMG2081 (الممرات 1 و 5 و 8 و 12) و LMG2081 / pG + host9lctLMG (الممرات 2 و 6 و 9 و 13) أو LMG2081 / pG + host9lcnG (الممرات 3 و 7 و 10 و 14) تم هضمه باستخدام NotI (الممرات من 1 إلى 3) أو SmaI (الممرات من 5 إلى 7) ، ولم يتم هضمه (الممرات من 8 إلى 10) أو معالجته باستخدام نوكلياز S1 (الممرات من 12 إلى 14). الممرات 4 و 11 ، كونكاتيمرز. السهام البيضاء والبلازميدات الخطية التي تحمل lctLMG سهام أوبرون السوداء ، الاختلافات في شظايا الكروموسومات بين سلالة WT و lactococcin G متحولة.

قياس الطيف الكتلي.

الشكل 5 المقايسة الحيوية لإنتاج اللاكتيسين LMG في L. lactis LMG2081 والتحليل الطيفي الكتلي. (أ) HPLC المرحلة العكسية. تم رصد الجزء النشط على أجار GM17 الناعم الذي تم تلقيحه بسلالة المؤشر L. lactis subsp. لاكتيس BGBM50. (ب) الكتلة الجزيئية المحسوبة من Lacticin LMG ، التي تحددها مطياف الكتلة ESI-TOF.

أسئلة لم تتم الإجابة عليها بخصوص الآلات المشاركة في المعالجة والتعميم

على الرغم من التقدم الحالي في تحديد بيولوجيا البكتريوسينات الدائرية ، فإن فهم الآليات الأنزيمية المشاركة في عمليات التدوير لا يزال غير مكتمل ويفتقر إلى الأدلة التجريبية. ومع ذلك ، يتم توجيه اهتمام كبير نحو تحديد آلية ما بعد النسخ وخطوات المعالجة المتضمنة في التفاعل (التفاعلات). تظل وظيفة الببتيدات القائد وطريقة انقسام القائد والخطوات المتضمنة في تعميم الببتيد غير معروفة. لا يزال من غير المعروف ، على سبيل المثال ، ما إذا كانت ردود الفعل للانضمام إلى نهاياتها من سلائف AS-48 المشقوقة خطيًا يتم تحفيزها بواسطة إنزيمين مختلفين في خطوات متزامنة تقريبًا أو عن طريق تفاعلين يتم تحفيزهما بواسطة نفس الإنزيم. ومع ذلك ، فقد تم التأكيد على أن جميع الجينات الهيكلية الدائرية يتم ترجمتها إلى سلائف الببتيدات ويقترح أن إنتاج الببتيدات الخطية الناضجة يتطلب إزالة زعيم N-terminal وانضمام نهايات المؤيدة للببتيد بواسطة التساهمية رابطة الببتيد (الشكل 2). ومن المثير للاهتمام ، أن القادة الذين تم فحصهم حتى الآن إما ممتدون (33 أو 35 وحدة بنائية للغاسريسين A و AS-48 ، على التوالي) أو لديهم فقط عدد قليل من بقايا الأحماض الأمينية (ثلاثة وستة وثمانية في التعميم A و uberolysin و subtilosin A ، على التوالي ) وتفتقر إلى أي تسلسلات محفوظة.

أبلغ Hegde & amp Bernstein (2006) مؤخرًا عن تعقيد التسلسل الرئيسي للبروتينات المفرزة مع تسلسل إشارة N-terminal القابل للانقسام الذي يتوسط في استهدافها وانتقالها عبر أغشية السيتوبلازم البكتيرية. يقترحون أن تسلسل الإشارات يحتوي على معلومات تحدد اختيار مسار الاستهداف ، وكفاءة النقل ، وتوقيت الانقسام وحتى وظائف ما بعد الانقسام ، وتلعب دورًا مهمًا في تعديل التكوين الحيوي للبروتين. ومع ذلك ، فإن غياب التماثل بين الأحماض الأمينية المشاركة في الانضمام إلى المصطلح والاختلافات الموجودة في قادة هذه البروتينات الدائرية يظل لغزًا. بعض الأسئلة العديدة التي لا يزال يتعين الإجابة عليها هي: هل هناك علاقة بين المواقع التي تتم فيها هذه العملية؟ هل الانقسام والإفراز مرتبطان؟ ما هي طبيعة الانتقال الوسيط المفترض؟ هل ATP مطلوب للطي خارج الغشاء؟ هل هناك آليات مختلفة تحكم عملية التعميم ، أم أنها تستخدم نفس المسارات الإفرازية؟

ومع ذلك ، في الأدبيات العلمية التي تم استعراضها كانت هناك محاولات لتعيين مثل هذه الوظائف لبعض منتجات الترميز المحددة. على سبيل المثال ، عندما توصل Kawulka (2003) إلى استنتاجاتهم حول الآلية الجينية اللازمة لإنتاج subtilosin A الناضج ، اقترحوا أن يكون الببتيدازات المعالجة AlbE و AlbF مرشحين لقطع القائد من الببتيد المسبق وتعميم المنتج الخطي . بالإضافة إلى ذلك ، فإن ألبا المنتج ، الذي ينتمي إلى عائلة بروتين SAM الجذرية ، والذي يشارك في تحفيز العديد من التفاعلات غير العادية ، سيشكل الارتباط المطلوب Cys-Phe الموصوف أعلاه (صوفيا ، 2001). بقدر ما يتعلق الأمر بالتعميم A ، لا يوجد دليل تجريبي لتحديد البروتين (البروتينات) المشاركة في معالجة و / أو تعميم مادة CirA prepeptide ، على الرغم من أن Kemperman (2003b) يشير إلى أن بروتين CirC يمكن أن يكون المرشح لأداء هذه الوظيفة ، إما بمفرده أو مع بروتينات CirB و / أو CirD. تم وصف حالة مماثلة ل ublB ، والذي تم اقتراحه كبروتين يشارك في تعميم أوبيروليسين (ويراوان ، 2007). ومع ذلك ، فإن هذه الاقتراحات تستند حصريًا إلى التماثلات المشتركة مع الجينات المشفرة للتعميم A أو enterocin AS-48. ومن المثير للاهتمام أن Martínez-Bueno (1998) قد اقترح أن As-48B ، بمفرده أو بالاشتراك مع As-48C 1 مجمع نقل D ، قد يفتح مسامًا على وجه التحديد لتسهيل خروج جزيئات AS-48. يمكن أن تشير هذه الفرضية إلى أن النشاط النهائي للمكون متعدد المكونات المفترض As-48BC 1 ستعمل بروتينات D على إزالة الببتيد القائد وتعزيز التعميم من الرأس إلى الذيل بالتزامن مع تصدير الجزيء. تظهر النتائج الأخيرة ، مع ذلك ، أن الانقسام أو التعميم (أو كليهما) يجب أن يتم من خلال آلية معينة من البكتيريا التي تنتمي إلى المكورات المعوية جنس (فرنانديز ، 2007) ، بافتراض أن المعالجة قد تتطلب بروتينات مساعدة مشتقة من الكروموسومات مماثلة لتلك الموصوفة لتعميم البلين في أغروباكتريوم توميفاسيانز (أيزنبرانت ، 2000 لاي ، 2002). لا يزال فهم الآلية الدقيقة الكامنة وراء معالجة AS-48 ونقله إلى سطح الخلية يمثل تحديًا رئيسيًا لأنه لم يتم تحديد أي منتج له نشاط الببتيداز المحدد الضروري والقدرة على إنتاج العمود الفقري AS-48 الدائري في ال مثل 48 العنقودية. لا تزال التكهنات قائمة حول متطلبات إما إنزيم واحد أو اثنين من الإنزيمات المشاركة في هذه العملية: على سبيل المثال إنزيم ترانسبيبتيداز غير نمطي من شأنه أن يحفز التفاعل المزدوج الضروري أو بدلاً من ذلك إشارة ببتيداز تشارك في الانقسام المحلل للبروتين لإزالة ببتيد قائد 35-amino-acid ، متبوعًا بإنزيم ثان يربط N-terminal M +1 إلى C-terminal W +70. أكثر من ذلك ، إذا تم استخدام ببتيداز إشارة عادية وشق رابطة الببتيد المنبع لبقايا H −1 ، فستكون هناك حاجة إلى إنزيم ثان لإزالة حمض (أحماض) أمينية بروبيبتيد N الزائدة وربط N- المحطة M +1 مع C-terminal W 70 (Martínez-Bueno ، 1994). أخيرًا ، قد يكون من المثير للاهتمام للغاية تأكيد ما إذا كان AS-48 لا يمكن التعبير عنه إلا من خلال مضيفه الطبيعي ( المكورات المعوية الأنواع) أو أيضًا حسب الأنواع من المطثية ، كما لوحظ في التعميم A ، أقرب بكتريوسينات دائرية موصوفة حتى الآن. ومع ذلك ، من أجل تعزيز فهمنا للآليات التي تعمل من خلالها ، يجب توسيع المستوى الحالي للمعرفة حول معالجة البريباكتيريوسين ليشمل الإنزيمات المعنية.


بعض أسباب مقاومة المضادات الحيوية

مقاومة المضادات الحيوية مشكلة صحية عالمية. كان وصف المضادات الحيوية على نطاق واسع مشكلة كبيرة لسنوات عديدة. وفقًا لمسح نُشر في عام 2002 ، زعم 97٪ من المستجيبين (الأطباء) أن السبب المهم لمقاومة المضادات الحيوية هو الاستخدام المكثف وغير المناسب للمضادات الحيوية في العلاجات الطبية (Wester). وآخرون. 2002). ومع ذلك ، يعتقد 60٪ فقط من الأطباء أن المزيد من التطبيقات المقيدة للمضادات الحيوية واسعة الطيف يمكن أن تقلل من مقاومة الأدوية (Wester وآخرون. 2002 فينش وهنتر 2006). كما أن نقص الأدوية الجديدة المضادة للميكروبات هو مصدر قلق كبير آخر. كانت شركات الأدوية الكبرى هي اللاعب الرئيسي في اكتشاف وتطوير عوامل جديدة مضادة للجراثيم بين أواخر العشرينيات وأوائل الستينيات ، ومع ذلك ، فقد تم تخصيص استثمارات أقل بكثير لهذا المجال البحثي المهم خلال الخمسين عامًا الماضية (Spellberg وآخرون. 2004 Overbye and Barrett 2005). من المحتمل أن يرجع أحد الأسباب الرئيسية لتناقص الفائدة إلى حقيقة أن شركات الأدوية لم تعد تجد هذا المجال مربحًا اقتصاديًا. أدى الافتقار إلى التمويل المناسب واللوائح القانونية الصارمة لإدخال أدوية جديدة (متوسط ​​8 سنوات لترخيص مضاد حيوي جديد) واللوائح الجديدة للحد من الاستخدام الواسع النطاق للعوامل المضادة للميكروبات في الأماكن العامة إلى انخفاض الحماس في صناعة الأدوية للدخول في هذا المجال. لذلك ، حولت الصناعة تركيزها نحو الأدوية الجديدة للأمراض المزمنة (مثل أمراض القلب والأوعية الدموية والألم والجهاز العصبي المركزي وعوامل خفض الكوليسترول) (Powers 2003 Spellberg وآخرون. 2004 فينش وهنتر 2006).


الآفاق المستقبلية

تم تنقية العديد من البكتريوسينات أو تحليلها وراثيًا في العديد من المكورات المعوية (الجدول 1) ، وتم العثور على المزيد من العزلات الجراثيم ، ولكن كياناتها النشطة لم يتم توصيفها بعد. من المدهش أن نلاحظ أنه من بين نباتات المختبر البرازي ، E. faecium من المحتمل أن يكون المنتج الأكثر شيوعًا للبكتريوسينات (Nes ، Forberg ، Salehian ، & # x00026 Holo ، 2005). بالإضافة إلى ذلك ، تخصيب الجراثيم E. faecium تم العثور عليه بين عزلات المستشفى المقاومة للفانكومايسين (VRE) (Inoue، Tomita، & # x00026 Ike، 2006 Todokoro، Tomita، Inoue، & # x00026 Ike، 2006). أكدت تسلسلات الجينوم العديدة التي تم نشرها في السنوات القليلة الماضية أيضًا الوفرة الكبيرة للبكتريوسينات التي تشفر الجينات في المكورات المعوية. من المثير للاهتمام أن نلاحظ أن البكتيريا المتطابقة يتم ترميزها بواسطة E. faecalis و E. faecium. تشير تسلسل الجينوم أيضًا إلى أن الجراثيم التي تشفر الجينات لا توجد فقط في المستشفى E. faecalis، ولكن أيضًا في عزلات المستشفى E. faecium.

السبب وراء تطوير المكورات المعوية مثل هذه القدرة على إنتاج الببتيدات المضادة للميكروبات غير معروف ، ولكن قد يتكهن المرء بأن إنتاج البكتيريا هو سمة مفيدة (سمة بروبيوتيك) في بعض البيئات (مثل الأمعاء البشرية). ومع ذلك ، فإن الإثراء المشترك لمقاومة المضادات الحيوية وبعض الصفات المسببة للجراثيم بين المكورات المعوية من الأصول السريرية تشير إلى أن إنتاج البكتيريا قد يكون مصدرًا مفيدًا يسمح بتكيف المكورات المعوية مع الظروف البيئية المختلفة. قد يعمل نظام البكتريوسين كنظام مضاد للسموم لزيادة استقرار البلازميد ، وبالتالي منع فقدان الجينات المقاومة للمضادات الحيوية المشفرة للبلازميد في ظل ظروف غير انتقائية. يبدو أن البكتيريا المميزة المرتبطة بمقاومة المضادات الحيوية تختلف عن البكتيريا الموجودة في المكورات المعوية المعزولة من الأفراد والأطفال الأصحاء (بيري ، بريد ، فوربرج ، هولو ، & # x00026 Nes ، 2010). في الحالة الأولى ، تم العثور بشكل متكرر على بكتريوسين 41 في العزلات السريرية ، ولكنه كان غائبًا في العزلات غير السريرية. علاوة على ذلك ، تم العثور على بكتريوسين 32 بترددات عالية بين VRE المقاومة والعزلات السريرية ، ولكن بترددات أقل بكثير بين العزلات البرازية للطلاب الأصحاء. تم توطين المكونات الجينية للبكتريوسين 32 على بلازميد مختلف عن جينات مقاومة الفانكومايسين ، وقد ثبت أيضًا أن هذه البكتيريا يمكن أن تكون مشتركة مع enterocin L50 (Inoue، Tomita، & # x00026 Ike، 2006 Izquierdo، Cai، مارشيوني ، & # x00026 النهار ، 2009).

من المغري التكهن بأن مقاومة المضادات الحيوية القابلة للتحويل تستفيد من أنظمة البكتريوسين لجعل هذه البكتيريا أكثر قدرة على المنافسة للنمو والبقاء في بيئة بها بكتيريا أخرى وثيقة الصلة & # x02014 ولكن يجب إجراء المزيد من الدراسات لدعم مثل هذه الفرضية.

يبدو أن الجهاز الهضمي البشري بيئة ممتازة للمكورات المعوية المنتجة للبكتيريا. لقد أظهرنا وآخرون أن المكورات المعوية المنتجة للبكتيريا توجد في معظم عينات براز الأطفال الأصحاء بترددات عالية نسبيًا ، مما يشير إلى أن المكورات المعوية المنتجة للبكتيريا مهمة في نمو البكتيريا المعوية عند الرضع.

على الرغم من أن معظم تركيز المكورات المعوية اليوم ينصب على قدرتها المرضية و VRE ، إلا أن المكورات المعوية هي مكون LAB رئيسي في الجهاز الهضمي لدينا ، وهي أيضًا كيان بكتيري رئيسي للعديد من منتجات الألبان واللحوم المحلية ، بالإضافة إلى المنتجات الغذائية المخمرة (Hugas ، Garriga ، & # x00026 Aymerich ، 2003).

لا يزال الدور (الأدوار) البيولوجية للبكتريوسينات في الطبيعة غير مفهومة جيدًا. هل البكتيريا مهمة لنباتات الأمعاء الصحية ، هل يمكن اعتبارها بروبيوتيك ، أم أن وجودها مؤشر على الفوعة أو مقاومة المضادات الحيوية؟ هذه بعض الأسئلة العاجلة والتحديات العلمية التي يجب التحقيق فيها. رؤية مفصلة فقط في المضيف-المكورات المعوية يمكن أن يعطينا التفاعل إجابات عن كيفية تقدير سماتها الإيجابية المحتملة بأمان وكيفية التعامل مع ميزاتها الإشكالية.


5. فرص تطبيق البكتريوسينات في صحة الإنسان

5.1 أنظمة توصيل البكتيريا

البكتريوسينات هي فئة أساسية من مادة البولي ببتيد. تم الإبلاغ عن مشاركتهم في تحسين صحة الأمعاء ، مثل الحد من استعمار البكتيريا المسببة للأمراض ، وتحسين الحاجز المعوي ، وتخفيف التهاب الأمعاء. إلى جانب ذلك ، ليس من السهل أن تسبب البكتيريا مقاومة للأدوية ولها تأثير ضئيل على الفلورا المتعايشة. على سبيل المثال ، قرص ثوريسين ، وهو جرثومة معدلة بعد الترجمة تنتجها ب. تورينجينسيس DPC 6431 مع نشاط مقابل جيم صعب، يمكن أن يكون كعلاج موجه في علاج جيم صعب- العدوى المصاحبة مع تقليل التأثير الجانبي على النباتات المتعايشة [87]. بعض البكتريوسينات ، مثل lasso peptide microcin J25 ، لها هياكل ثابتة لتجنب التحلل بواسطة البروتياز في الجهاز الهضمي [80] ومع ذلك ، فإن معظم البكتيريا معرضة للتحلل بواسطة البروتياز عند تناولها عن طريق الفم ، مما يؤدي إلى فقدان النشاط المضاد للميكروبات. نتيجة لذلك ، تم اختبار جزء صغير فقط من البكتريوسينات في الجسم الحي عن طريق الحقن داخل الصفاق أو تغذية الأنف أو وضعه على الجلد. لذلك ، فإن طرق التسليم الفعالة ضرورية لضمان عدم تدهورها عند وصولها إلى الأمعاء.

يمكن استخدام الجسيمات النانوية (أي الجسيمات النانوية المعدنية والجسيمات النانوية العضوية والأغلفة النانوية والألياف النانوية) والبروبيوتيك والمواد الهلامية كنظم توصيل جرثومي [88]. على سبيل المثال ، الجسيمات النانوية النانوية لها تأثير إطلاق مستمر مقارنة مع النيسين وحده ، مما يطيل وقت العمل لعلاج داء المبيضات المهبلي المتكرر [89] ، ويساهم الإطلاق البطيء في إطالة مدة التأثير. بالإضافة إلى ذلك ، تعزز بعض طرق التوصيل نشاط البكتريوسينات. على سبيل المثال ، بالمقارنة مع enterocin وحده ، فإن الجسيمات النانوية الفضية المغطاة بالأمعاء (En-SNPs) التي يتم تصنيعها بواسطة enterocin و nanosilver لها نشاط مضاد للجراثيم أقوى ضد العديد من مسببات الأمراض المنقولة بالغذاء (على سبيل المثال ، بكتريا قولونية ATCC 25922 ، B. cereus, K. الرئوية, L. monocytogenes, M. luteus, P. acidilactici LB42 ، S. flexneri، و بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية) [90]. محيد وآخرون وصف خمسة بكتريوسينات فعالة ضد مرض السل. بعد التضمين في الجسيمات الشحمية (فوسفاتيديل كولين: كارديوليبين & # x02009 = 3 & # x02009: & # x020091) ، أربعة منها أفضل من ريفامبيسين (يستخدم تقليديا للعلاج مرض السل عدوى) في الجسم الحي [91]. ومع ذلك ، كأفضل ما لدينا من معلومات ، فإن أنظمة التوصيل هذه لها تأثير ضئيل فقط في حل مشكلة تدهور البروتياز.

تم الإبلاغ عن العديد من البروبيوتيك لتحمل بيئة الجهاز الهضمي واستعمار الأمعاء بنجاح. وبالتالي ، تعمل البروبيوتيك المنتجة للبكتيريا كمركبات لنقل البكتيريا إلى القناة المعوية لتأثيراتها المفيدة. Malvisi et al. وجدت أن السلالات المنتجة للنسين تظهر نشاطًا مضادًا للميكروبات أقوى ضد البكتيريا المسببة لالتهاب الضرع من السلالات غير المنتجة للنيزين [92]. وبالمثل ، يين وآخرون. أظهر نشاطًا مضادًا للالتهابات أكبر في تغذية الفئران L. الأخمصية مقارنة بالسلالة الطافرة التي تفتقر إلى البكتريوسين البكتريسين [93]. بدوره ، فإن إنتاج البكتريوسينات يعزز استعمار بكتيريا الكائنات الحية المجهرية ، مما يسهل احتلالها لمنافذ بيئية ويقلل من استعمار البكتيريا المسببة للأمراض [94]. وبالتالي ، يمكن استخدام السلالات المنتجة للبكتيريا كمركبات لمساعدة البكتيريا على الاستعمار والعمل في أبحاث الجهاز الهضمي.

5.2 زيادة إنتاج ونشاط البكتريوسينات بواسطة الهندسة الوراثية

عادة ما يكون إنتاج البكتريوسينات في السلالات الأصلية منخفضًا ، ويتم ترميز بعض البكتيريا بواسطة البلازميدات ولا يتم إنتاجها في غلات مستقرة. زيادة محصول البكتريوسينات ذات أهمية كبيرة للبحث وتطبيق البكتريوسينات. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تحسين نشاط بعض البكتريوسينات في الممارسة العملية ، والتي يمكن أن تقلل أيضًا من كمية البكتريوسينات المستخدمة وبالتالي تحل بشكل غير مباشر مشكلة عدم كفاية إنتاج البكتريوسين. تعد الهندسة الوراثية حلاً جيدًا لكل من هاتين المشكلتين. لزيادة إنتاج البكتريوسين ، ني وآخرون. استخدم ناقل التعبير المكوك pMG36e مع المروج التأسيسي القوي p32 لزيادة تعزيز إنتاج النيسين عن طريق الإفراط في التعبير عن الجينات نيسا, نسرك و nisFEG في L. اللاكتيس LS01 [95]. كونغ وآخرون. حصل على مجموعة الجينات الكاملة 14.5 & # x02009kb من nisin من L. اللاكتيس البكتيريا المنتجة لـ K29 nisin ، تم نقلها إلى L. اللاكتيس MG1363 مع pccam& # x003b21 بلازميد ، وأفرط في التعبير عن الجين الببتيد الأساسي نيسا، وبالتالي زيادة محصول النيسين [96]. لتعزيز نشاط البكتيريا ، Zhou et al. إرفاق ذيل (PRPPHPRL) من apidaecin 1b إلى nisin ، ونشاط nisin ضد بكتريا قولونية تمت زيادة CECT101 بأكثر من ضعفين [97]. في الآونة الأخيرة ، ستيفن وآخرون. حسنت من نشاط الببتيدات المضادة للميكروبات ضد البكتيريا المسببة للأمراض ووسعت نطاق التثبيط عن طريق الخلط التجميعي لوحدات الببتيد المكونة من 12 لانثي ببتيد. [98] بشكل عام ، تعتبر الهندسة الوراثية طريقة فعالة لزيادة إنتاج البكتريوسين وتعزيز نشاط البكتريوسين.

5.3 البكتيريا كمضادات للميكروبات محدودة الطيف يجب أن تكون ضرورية لصحة الكائنات الحية الدقيقة البشرية

تتكون الكائنات الحية الدقيقة البشرية من مجتمع متنوع من البكتيريا ، ويرتبط التركيب الميكروبي وتغيرات الوفرة بمجموعة من الأمراض التي تصيب الإنسان. يمكن لإدارة المضادات الحيوية واسعة الطيف أن تقلل بشكل كبير من تنوع ميكروبيوتا الأمعاء وتسبب العديد من الآثار الجانبية. على سبيل المثال ، يحدث الإسهال المرتبط بالمضادات الحيوية عندما ينقطع توازن & # x0201cgood والبكتيريا السيئة & # x0201d في الجهاز الهضمي بعد تناول المضادات الحيوية.

العديد من البكتريوسينات لها طيف أضيق نسبيًا وتستهدف القليل من البكتيريا المحددة مقارنة بالمضادات الحيوية التي لها نشاط واسع الطيف. نظرًا لأن البكتريوسينات عادةً ما تثبط البكتيريا وثيقة الصلة ، فقد أظهرت بعض البكتيريا التي تنتجها مسببات الأمراض نشاطًا محددًا مضادًا للميكروبات للبكتيريا المسببة للأمراض ذات الصلة. على سبيل المثال ، انتحار المضاد الحيوي من S. suis له تأثير مثبط ضد S. جوردوني والتي يمكن أن تسبب تعفن الدم البشري [99]. Klebocin من عزلات سريرية من K. الالتهاب الرئوي تظهر النشاط المضاد للميكروبات للأنواع المسببة للأمراض من المعوية [100]. Aureocins التي تنتجها بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية له تأثير مثبط قوي على بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية و S. agalactiae [101]. بالإضافة إلى ذلك ، ليس للبكتريوسينات أي تأثير على النباتات الميكروبية الطبيعية بسبب طيفها الضيق. على سبيل المثال ، يتم إنتاج diffocin بواسطة جيم صعب CD4 ويمكن أن تقتل الآخرين على وجه التحديد جيم صعب سلالات. منع الانتشار المعدل تمامًا من الاستقرار المعوي لـ جيم صعب دون إصابة الجراثيم المعوية عن طريق الفم في الفئران [102]. التشابه ، قرص الثوريسين المنتج من قبل ب. تورينجينسيس أظهر DPC 6431 القضاء على جيم صعب وله تأثير ضئيل على الأجناس الطبيعية في القناة الهضمية [87]. يقلل تدخل Microcin J25 في نموذج الإسهال من العوامل الممرضة بكتريا قولونية الاستعمار مع تحسين علم الأحياء الدقيقة المعوي [32]. لذلك ، فإن الجراثيم لديها إمكانات كبيرة لاستخدامها كمثبط بكتيري ضيق الطيف لعلاج الأمراض المرتبطة بالعدوى في الإنسان.

في الممارسة العملية ، تعتبر سلامة بعض البكتيريا مصدر قلق لأن البكتيريا المنتجة لها مسببة للأمراض. لذلك ، بالنسبة لهذه البكتريوسينات ، يمكن استخدام البكتريوسينات المنقاة أو البكتيريا بروبيوتيك غير المتجانسة التي تعبر عن البكتريوسين بدلاً من السلالات المنتجة. ومن الجدير بالذكر أن تقييم سلامة صارم للبكتريوسينات في المختبر و في الجسم الحي ضروري قبل التطبيق العملي ، بغض النظر عما إذا كان المصدر بروبيوتيك أو مسببًا للأمراض.


أسئلة لم تتم الإجابة عليها بخصوص الآلات المشاركة في المعالجة والتعميم

على الرغم من التقدم الحالي في تحديد بيولوجيا البكتريوسينات الدائرية ، فإن فهم الآليات الأنزيمية المشاركة في عمليات التدوير لا يزال غير مكتمل ويفتقر إلى الأدلة التجريبية. ومع ذلك ، يتم توجيه اهتمام كبير نحو تحديد آلية ما بعد النسخ وخطوات المعالجة المتضمنة في التفاعل (التفاعلات). تظل وظيفة الببتيدات القائد وطريقة انقسام القائد والخطوات المتضمنة في تعميم الببتيد غير معروفة. لا يزال من غير المعروف ، على سبيل المثال ، ما إذا كانت ردود الفعل للانضمام إلى نهاياتها من سلائف AS-48 المشقوقة خطيًا يتم تحفيزها بواسطة إنزيمين مختلفين في خطوات متزامنة تقريبًا أو عن طريق تفاعلين يتم تحفيزهما بواسطة نفس الإنزيم. ومع ذلك ، فقد تم التأكيد على أن جميع الجينات الهيكلية الدائرية يتم ترجمتها إلى سلائف الببتيدات ويقترح أن إنتاج الببتيدات الخطية الناضجة يتطلب إزالة زعيم N-terminal وانضمام نهايات المؤيدة للببتيد بواسطة التساهمية رابطة الببتيد (الشكل 2). ومن المثير للاهتمام ، أن القادة الذين تم فحصهم حتى الآن إما ممتدون (33 أو 35 وحدة بنائية للغازريسين A و AS-48 ، على التوالي) أو لديهم فقط عدد قليل من بقايا الأحماض الأمينية (ثلاثة وستة وثمانية بالنسبة لـ Circularin A و uberolysin و subtilosin A ، على التوالي ) وتفتقر إلى أي تسلسلات محفوظة.

أبلغ Hegde & amp Bernstein (2006) مؤخرًا عن تعقيد التسلسل الرئيسي للبروتينات المفرزة مع تسلسل إشارة N-terminal القابل للانقسام الذي يتوسط في استهدافها وانتقالها عبر أغشية السيتوبلازم البكتيرية. يقترحون أن تسلسل الإشارات يحتوي على معلومات تحدد اختيار مسار الاستهداف ، وكفاءة النقل ، وتوقيت الانقسام وحتى وظائف ما بعد الانقسام ، وتلعب دورًا مهمًا في تعديل التكوين الحيوي للبروتين. ومع ذلك ، فإن غياب التماثل بين الأحماض الأمينية المشاركة في الانضمام إلى المصطلح والاختلافات الموجودة في قادة هذه البروتينات الدائرية يظل لغزًا. بعض الأسئلة العديدة التي لا يزال يتعين الإجابة عليها هي: هل هناك علاقة بين المواقع التي تتم فيها هذه العملية؟ هل الانقسام والإفراز مرتبطان؟ ما هي طبيعة الانتقال الوسيط المفترض؟ هل ATP مطلوب للطي خارج الغشاء؟ هل هناك آليات مختلفة تحكم عملية التعميم ، أم أنها تستخدم نفس المسارات الإفرازية؟

ومع ذلك ، في الأدبيات العلمية التي تم استعراضها كانت هناك محاولات لتعيين مثل هذه الوظائف لبعض منتجات الترميز المحددة. على سبيل المثال ، عندما توصل Kawulka (2003) إلى استنتاجاتهم حول الآلية الجينية اللازمة لإنتاج subtilosin A الناضج ، اقترحوا أن يكون الببتيدازات المعالجة AlbE و AlbF مرشحين لقطع القائد من الببتيد المسبق وتعميم المنتج الخطي . بالإضافة إلى ذلك ، فإن ألبا المنتج ، الذي ينتمي إلى عائلة بروتين SAM الجذرية ، والذي يشارك في تحفيز العديد من التفاعلات غير العادية ، سيشكل الارتباط المطلوب Cys-Phe الموصوف أعلاه (صوفيا ، 2001). بقدر ما يتعلق الأمر بالتعميم A ، لا يوجد دليل تجريبي لتحديد البروتين (البروتينات) المشاركة في معالجة و / أو تعميم مادة CirA prepeptide ، على الرغم من أن Kemperman (2003b) يشير إلى أن بروتين CirC يمكن أن يكون المرشح لأداء هذه الوظيفة ، إما بمفرده أو مع بروتينات CirB و / أو CirD. تم وصف حالة مماثلة ل ublB ، والذي تم اقتراحه كبروتين يشارك في تعميم أوبيروليسين (ويراوان ، 2007). ومع ذلك ، فإن هذه الاقتراحات تستند حصريًا إلى التماثلات المشتركة مع الجينات المشفرة للتعميم A أو enterocin AS-48. ومن المثير للاهتمام أن Martínez-Bueno (1998) قد اقترح أن As-48B ، بمفرده أو بالاشتراك مع As-48C 1 مجمع نقل D ، قد يفتح مسامًا على وجه التحديد لتسهيل خروج جزيئات AS-48. يمكن أن تشير هذه الفرضية إلى أن النشاط النهائي للمكون متعدد المكونات المفترض As-48BC 1 ستعمل بروتينات D على إزالة الببتيد القائد وتعزيز التعميم من الرأس إلى الذيل بالتزامن مع تصدير الجزيء. تظهر النتائج الأخيرة ، مع ذلك ، أن الانقسام أو التعميم (أو كليهما) يجب أن يتم من خلال آلية معينة من البكتيريا التي تنتمي إلى المكورات المعوية جنس (فرنانديز ، 2007) ، بافتراض أن المعالجة قد تتطلب بروتينات مساعدة مشتقة كروموسوميًا مماثلة لتلك الموصوفة لتعميم البلين في أغروباكتريوم توميفاسيانز (أيزنبرانت ، 2000 لاي ، 2002). لا يزال فهم الآلية الدقيقة الكامنة وراء معالجة AS-48 ونقله إلى سطح الخلية يمثل تحديًا رئيسيًا لأنه لم يتم تحديد أي منتج له نشاط الببتيداز المحدد الضروري والقدرة على إنتاج العمود الفقري AS-48 الدائري في ال مثل 48 العنقودية. لا تزال التكهنات قائمة حول متطلبات إما إنزيم واحد أو اثنين من الإنزيمات المشاركة في هذه العملية: على سبيل المثال إنزيم ترانسبيبتيداز غير نمطي من شأنه أن يحفز التفاعل المزدوج الضروري أو بدلاً من ذلك إشارة ببتيداز متورطة في الانقسام المحلل للبروتين لإزالة ببتيد قائد 35-amino-acid ، متبوعًا بإنزيم ثان يربط N-terminal M +1 إلى C-terminal W +70. أكثر من ذلك ، إذا تم استخدام ببتيداز إشارة عادية وشق رابطة الببتيد المنبع لبقايا H −1 ، فستكون هناك حاجة إلى إنزيم ثان لإزالة حمض (أحماض) أمينية بروبيبتيد N الزائدة وربط N- المحطة M +1 مع C-terminal W 70 (Martínez-Bueno ، 1994). أخيرًا ، قد يكون من المثير للاهتمام للغاية تأكيد ما إذا كان AS-48 لا يمكن التعبير عنه إلا من خلال مضيفه الطبيعي ( المكورات المعوية الأنواع) أو أيضًا حسب الأنواع من المطثية ، كما لوحظ في التعميم A ، أقرب بكتريوسينات دائرية موصوفة حتى الآن. ومع ذلك ، من أجل تعزيز فهمنا للآليات التي تعمل من خلالها ، يجب توسيع المستوى الحالي للمعرفة حول معالجة البريباكتيريوسين ليشمل الإنزيمات المعنية.


نتائج

تحديد هيكل Y. pestis FyuA والمبيدات.

بدأنا هذا المشروع من خلال تحديد هيكل FyuA ، وهو ناقل غشاء خارجي بقدرة 71 كيلو دالتون ينقل عادة يرسينياباكتين الحديدي (Fe-Ybt) وهو مهم للفوعة في بعض يرسينيا و بكتريا قولونية سلالات. تم التعبير عن FyuA في بكتريا قولونيةومنقى وبلور باستخدام المنظفات LDAO و C8ه4. انحرفت البلورات إلى دقة 3.2 ، وتم حل الهيكل عن طريق تشتت شاذ بطول موجة واحد (الجدول S1). يتميز هيكل FyuA بميزات نموذجية لعائلة الناقل المعتمد على TonB (الشكل 1أ) (18) بما في ذلك غشاء 22 حبلا β برميل يتم حظر مسامها بواسطة مجال سدادة. على الجانب المحيط بالغشاء ، ترتبط خيوط β الفردية من البرميل عن طريق لفات قصيرة ، بينما ترتبط الخيوط الجانبية خارج الخلية بحلقات طويلة خارج الخلية من L1 إلى L11. جزء من L8 مضطرب (المخلفات 487-492). شكل صندوق TonB (STLVVTA ، المخلفات 8-14) ضروري للتفاعل مع TonB-ExbB-ExbD (13 ، 19) ولا يمكن رؤيته إلا جزئيًا في الهيكل (البقايا 1-12 غير مرتبة). تمنع الطفرات في صندوق TonB نقل حاملي الحديد والبكتريوسينات (6).

الهياكل البلورية Y. pestis FyuA and pesticin. (أ) The crystal structure of FyuA consists of two domains: the β-barrel in green and the plug domain in red. The TonB box of FyuA was mostly disordered and not observed in the crystal structure. In the periplasmic view of FyuA, the location of the TonB box is not shown for clarity. (ب) The crystal structure of pesticin consists of two distinct domains: The predominantly β-sheet N-terminal domain (FyuA binding domain) in purple and encompasses residues 1–164. The mainly α-helical C-terminal domain (residues 168–357) in gold (killing domain). A short linker connects the two domains and is shown in cyan that spans residues 165–167. The TonB box of pesticin was disordered and not observed in the crystal structure. The residues mutated in this study are labelled and shown in stick representation and include residues in the presumed active site of pesticin. (ج) To illustrate that the C-terminal domain of pesticin is structurally similar to T4 lysozyme, the crystal structure of T4 lysozyme (green) (PDB code = 2LZM) is represented in the same orientation as the C-terminal domain of pesticin. Similarity between the two proteins is primarily structural there is little sequence identity except for a partial conservation of active site residues that is apparent after a structural alignment. (د) Superimposition of the pesticin (gold) and T4 lysozyme (green) active sites shows that the catalytic threonine and glutamate residues are conserved in pesticin, whereas the catalytic aspartate in lysozyme is replaced by a proline in pesticin. Therefore, pesticin shares a functional resemblance to T4 lysozyme, but the active sites are not identical. For clarity, representation of secondary structure elements was omitted in د.

To learn more about how pesticin kills bacteria expressing FyuA, we solved the 2.1 Å crystal structure of pesticin (40 KDa) using multiwavelength anomalous dispersion (Table S1). The structure of pesticin consists of two domains joined by a short linker (Fig. 1ب). The N-terminal domain is formed by a seven-strand antiparallel β-sheet with two α-helices inserted between strands 5 and 6 and an additional α-helix following strand 7. The C-terminal domain of pesticin is primarily α-helical, except for a small irregular antiparallel three-strand β-sheet (Fig. 1ب). The N-terminal 13 residues are disordered in the structure. This region includes the TonB box motif (DTMVV, residues 3–7) (10) which is necessary for type B bacteriocins to be translocated across the outer membrane. Other regions that could not be resolved include residues 25–34 (25–32 in noncrystallographic symmetry related copy B) and the C-terminal residue.

Pesticin Shares Structural Similarity with Phage T4 Lysozyme.

Pesticin does not resemble any other known bacteriocin in sequence or structure (6) so, we analyzed the pesticin fold using the DALI server (20) to search for other structural homologs. DALI analysis revealed a striking similarity between the C-terminal domain of pesticin and phage T4 lysozyme (21) that had not been postulated prior to the structure determination because the sequence similarity is low (Fig. 1ج والشكل S1). T4 lysozyme is an archetypal lysin, and members of the T4 lysozyme family have an essential catalytic triad corresponding to E11, D20, and T26 (Fig. 1 بد) (22). Two of these residues are conserved in pesticin: E178 and T201. We confirmed that E178 and T201 are active site residues by mutating them to alanine, which completely abolished pesticin activity using a bactericidal assay (Fig. S2).

Structure Determination of a Pesticin-T4 Lysozyme Hybrid.

The structural and functional resemblance between the two proteins suggested that we could create a hybrid lysin by fusing the N-terminal domain of pesticin to T4 lysozyme, an idea that only became clear upon analyzing the pesticin structure. The hybrid lysin thus consists of a Y. pestis “FyuA-targeting” domain and a T4 phage “killing” domain (Fig. S3). We crystallized the hybrid lysin and solved the structure by molecular replacement to 2.6 Å (Table S1 and Fig. S4أ). Like pesticin, the hybrid lysin consists of two domains folded similarly to wild type pesticin (Fig. S4 د و ه). The individual domains have an rmsd of 0.5 Å with their counterparts in pesticin. Two slightly different conformations were observed within the asymmetric unit of the hybrid structure with the only difference being a small rotation of the T4 lysozyme domain relative to the targeting domain however, the position and orientation of the lysozyme killing domain of the hybrid was rotated ∼90 degrees relative to the killing domain of wild type pesticin.

Pesticin and the Hybrid Lysin Specifically Target Cells Expressing FyuA.

To evaluate the engineered hybrid lysin, we needed a method to assess wild type pesticin activity. We established a bactericidal assay using بكتريا قولونية cells expressing Y. pestis FyuA from a pET20b vector. As expected, we found that pesticin was able to kill بكتريا قولونية cells expressing FyuA (Fig. 2أ), whereas control cells containing unmodified pET20b were completely resistant (Fig. 2ج). We then used this assay to determine whether our pesticin-lysozyme hybrid would kill بكتريا قولونية cells expressing FyuA. The hybrid lysin was able to kill fyuA + cells in the bactericidal assay (though to a lesser extent than pesticin). بالنسبة إلى fyuA - cells (Null), the sample treated with pesticin survived similarly to the untreated control, whereas the sample treated with hybrid lysin showed low levels of cell death. The level of killing, however, was small compared to the level seen when the hybrid lysin was added to cells expressing FyuA. These data indicate that killing by the hybrid largely depends on FyuA expression (Fig. 2 أ و ج). We also confirmed that fyuA + cells are not killed by the addition of purified T4 lysozyme (Fig. S2). Because cell death arises from peptidoglycan degradation in the periplasm, our results indicate that T4 lysozyme was transported across the outer membrane when attached to the N-terminal domain of pesticin.

Bactericidal assays demonstrate that pesticin and the hybrid lysin kill بكتريا قولونية cells expressing FyuA. Pesticin or hybrid lysin at a concentration of 100 μg/mL was added to بكتريا قولونية T7 express cells in PBS at 37 °C while shaking. Control cultures had no proteins added. Samples were removed at several time points, plated, and surviving bacterial colonies were counted. These experiments were repeated at least three times. The standard error of the mean is shown. (أ) Cells expressing fyuA are killed by pesticin and the hybrid lysin. (ب) Cells expressing fyuA و pim are killed by the hybrid lysin but not by pesticin due to protection conferred by the pesticin immunity protein. Note that the immunity protein cannot protect against killing by the hybrid lysin. (ج) بكتريا قولونية T7 express cells transformed with pET20b (Null) are resistant to killing by pesticin or the hybrid lysin because they do not express fyuA on the cell surface.

We tested pesticin’s ability (at high and low concentrations) to inhibit the growth of fyuA + cells and found that each concentration inhibited growth similarly (Fig. S5). In contrast, colicin Ia is self-inhibitory at high concentrations because colicin Ia requires two copies of its receptor Cir, one for initial cell binding and the other for translocation across the outer membrane (23). As a result, at high concentration colicin Ia binds all the available Cir on the cell surface and then cannot find free Cir for translocation. Because high concentrations of pesticin inhibited growth similarly compared to low concentrations, this suggests that pesticin only requires one copy of FyuA to bind and enter the cell or that another unknown receptor could be involved.

The Hybrid Lysin Is Not Inactived by Pesticin Immunity Protein.

We next asked whether Pim could inhibit the toxicity of our hybrid lysin. Y. pestis strains producing pesticin are protected from cell death by Pim. To test whether the hybrid lysin could overcome the natural immunity conferred by Pim, we constructed a vector that expresses the fyuA و pim genes concomitantly. Fig. 2ب shows that the expression of Pim protects against killing by pesticin: بكتريا قولونية cells transformed with this vector were not killed by pesticin at a concentration of 100 μg/mL. In contrast, adding 100 μg/mL of the hybrid lysin to cells expressing Pim and FyuA resulted in cell death (Fig. 2ب). Therefore, the pesticin-lysozyme hybrid can overcome the natural immunity of Pim-producing strains giving it an advantage over pesticin by extending its potential therapeutic application to a wide variety of Yersiniae.

Yersinia and UPEC Strains Are Sensitive To Pesticin and the Hybrid Lysin.

To confirm that our observations in the بكتريا قولونية model system were consistent with the response of bacteria that naturally express FyuA, we tested Y. pestis و Y. pseudotuberculosis for their sensitivity to pesticin and the hybrid lysin (Fig. S6). Pesticin killed Y. pseudotuberculosis و Y. pestis KIM10+ but not Y. pestis KIM6+. The presence of the pPCP1 plasmid (24) that encodes pesticin and Pim renders KIM6+ insensitive to pesticin action. من ناحية أخرى، Y. pestis KIM6+ was sensitive to killing by the hybrid lysin, though to a lesser degree compared to Y. pestis KIM10+. These data indicate that the hybrid can circumvent the action of Pim in Y. pestis. A possible explanation for why the hybrid lysin does not kill Y. pestis KIM6+ as efficiently as Y. pestis KIM10+ could be the presence of the outer membrane protease Pla in the KIM6+ strain but not in the KIM10+ strain. It is possible that Pla can degrade the hybrid lysin on the cell surface before it can be transported to the periplasm. Because the hybrid lysin kills بكتريا قولونية in the presence or absence of Pim at similar levels (Fig. 2), we think it is unlikely that Pim partially deactivates the hybrid lysin in Y. pestis ولكن ليس في بكتريا قولونية.

The bactericidal activities of pesticin and hybrid lysin were also tested against بكتريا قولونية clinical isolates. We tested both proteins against three uropathogenic بكتريا قولونية (UPEC) laboratory strains and eighteen clinical isolates whose fyuA genotype had been previously determined (25). Of these, all fyuA + clinical isolates and laboratory strains were susceptible to pesticin and hybrid causing 98% and 90% reduction in bacterial viability, respectively (Fig. S7). Importantly, the bactericidal effect of pesticin and hybrid lysin was observed against recurrent and asymptomatic بكتريا قولونية clinical isolates indicating that the origin of the strains does not affect bactericidal activity of these proteins however, neither pesticin nor hybrid lysin is bactericidal against fyuA - strains indicating that these toxin proteins retain specificity for pathogenic subtypes expressing fyuA.

Investigation of Pesticin and Hybrid Action by Cryo-Electron Microscopy.

Next, we used cryo-electron microscopy to visualize changes in cell morphology upon addition of T4 lysozyme, hybrid lysin, and pesticin proteins. Intact cells are too thick to yield useful information except around their periphery where the trilaminar envelope is clearly visualized. In an untreated بكتريا قولونية fyuA + control sample, almost all observed cells (∼90%) were intact and had normal envelope morphology however, a small but significant fraction of cells (∼8%) was visibly perturbed and represent the background level of cell disruption that occurs in an untreated culture (Fig. 3أ and Fig. S8أ). Addition of hybrid lysin had a dramatic effect ∼45% of observed cells exhibited gross disruption characterized by vesiculation of the inner and outer cell membranes and loss of cellular integrity (Fig. 3 ب و ج and Fig. S8 أ و ه). This kind of vesiculation was not seen when cells were treated with either T4 lysozyme or pesticin (Fig. S8 أ, ج، و د). In contrast to hybrid lysin treatment, the distribution of cell morphologies observed after T4 lysozyme treatment was not altered to a statistically significant degree though the percentage of disrupted cells (∼16%) was slightly higher than the untreated control. Treatment with pesticin resulted in significant but less dramatic disruption of ∼21% of cells (Fig. S8أ). Pesticin disruption appeared distinct from hybrid protein disruption and is characterized by the appearance of holes in the outer membrane and eventual cell rupture (Fig. S8 ج و د). The distinct morphological characteristics of cells disrupted by the hybrid lysin vs. pesticin may indicate that the two proteins are bacteriolytic through differing mechanisms of action but, further experiments are required to confirm this.

Cryo-EM of fyuA + بكتريا قولونية cells treated with the hybrid lysin. Electron micrographs of fyuA + بكتريا قولونية cells plunge-frozen on holey-carbon mesh coated sample grids. Cells were incubated with (أ) no treatment (control) or (ب و ج) 100 μg/mL hybrid lysin for 10 min before being plunge-frozen. Extensive membrane breakdown of the treated cell in (ب) is apparent. As a result, the cell is weakened and, consequently, spreads and flattens in the thin film of buffer while largely preserving its 3D surface area. As a result, it projects a larger 2D area in the micrograph. Also, as it is so much thinner, the membrane vesiculation is evident all over the cell, not just around the edges. ال insets show typical regions of the corresponding cell envelopes at higher magnification. The intact inner membrane (IM), peptidoglycan layer (PG), and outer membrane (OM) are indicated and labeled in (أ). Characteristic vesiculation of inner and outer cell membranes is shown in (ب) و (ج).

Transport Across the Outer Membrane.

Our bactericidal experiments establish that pesticin and the hybrid lysin require FyuA for transport across the outer membrane, and the electron microscopy images allow visualization of cell destruction once the toxin has entered the periplasm however, the import pathway remains unclear. If pesticin and the hybrid lysin were transported through the FyuA β-barrel, then unfolding of the bacteriocin would likely be required because the dimensions of the pore do not appear to accommodate fully folded pesticin or hybrid (Fig. 4). To probe the import pathway further, we created a thermostable hybrid lysin by fusing a fully active T4 lysozyme mutant containing two disulfide bonds (26) to the FyuA-binding domain of pesticin. The disulfide bonds would presumably prevent unfolding of the T4L domain under conditions of the bactericidal assay. To confirm proper fold and disulfide bond formation, the thermostable bacteriocin was crystallized and the structure solved by molecular replacement to 1.8 Å resolution (Table S1 and Fig. S4 ب و ج). Although the killing domain of this protein is unlikely to unfold, the thermostable hybrid killed fyuA + بكتريا قولونية almost as effectively as the “wild type” hybrid with 0.8% survival for the hybrid lysin compared to 10% survival for the thermostable hybrid lysin. This result suggests that the import pathway does not require complete unfolding of the bacteriocin.

The pore of the FyuA β-domain is too small to transport directly folded pesticin or the thermostable hybrid across the outer membrane. The β-domain of FyuA is shown in light green and the plug domain in red, yersiniabactin (ybt) in spheres, pesticin (pst) in gold, and thermostable pst-hybrid (TS-hybrid) in dark green with the location of the engineered disulfide shown as yellow spheres (Fig. S4). For comparison, dimensions of the FyuA pore, Ybt, Pst, and TS-hybrid are shown with units in nanometers. ال أعلى row represents a periplasmic view up through the pore of the FyuA beta domain, whereas the وسط row represents a membrane (side) view. The bottom row shows an overlay of FyuA with Ybt and Pst illustrating the size restrictions preventing direct transport of Pst (assuming the plug domain is fully ejected).


معلومات الكاتب

الانتماءات

Midwest Center for Structural Genomics and Structural Biology Center, Biosciences Division, Argonne National Laboratory, Argonne, Illinois, 60439, USA

Changsoo Chang, Lour Volkart & Andrzej Joachimiak

Wellcome Trust Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, CB10 1SA, UK

Penny Coggill, Alex Bateman & Robert D Finn

Midwest Center for Structural Genomics, Department of Molecular Physiology and Biological Physics, University of Virginia, Charlottesville, VA, 22903, USA

Marcin Cymborowski & Wladek Minor

Midwest Center for Structural Genomics, Department of Biochemistry, UT Southwestern Medical Center at Dallas, Dallas, TX, 75235, USA


شاهد الفيديو: Можно ли пить перекись водорода? Что произойдет с организмом, если выпить перекись водорода. (قد 2022).


تعليقات:

  1. Azi

    ما هي الكلمات المناسبة ... الفكرة الرائعة والرائعة

  2. Midal

    بيننا نتحدث ، أنصحك بمحاولة البحث في google.com

  3. Neill

    أعتذر عن التدخل ... أنا هنا مؤخرًا. لكن هذا الموضوع قريب جدًا مني. اكتب إلى PM.

  4. Druce

    أعني أنك مخطئ. يمكنني إثبات ذلك. اكتب لي في رئيس الوزراء ، سنتحدث.

  5. Kasper

    الآن أصبح كل شيء واضحًا ، شكرًا جزيلاً على التفسير.

  6. Armanno

    جنون غبي !!! ممتاز



اكتب رسالة