معلومة

الرحلان الكهربائي للهلام بعد العلاج بالـ RNAse

الرحلان الكهربائي للهلام بعد العلاج بالـ RNAse


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لا أفهم كيف أحل هذا السؤال. أعلم أن RNAse سيقطع قطعًا أصغر من RNA.

الجواب المعطى هو أ


السؤال غامض بعض الشيء في بعض الأجزاء المهمة ، لذلك سأضطر إلى وضع بعض الافتراضات حول ما قصده المؤلفون على الأرجح.

RNAses هي إنزيمات تحط من الحمض النووي الريبي. هناك عدد قليل من الأنواع المختلفة التي تؤدي إلى أنواع مختلفة من التدهور. النوع الذي قد تستخدمه في تجربة مثل هذا هو RNAse تماما يحط من الحمض النووي الريبي. والغرض من ذلك هو التمكن من تمييز الحمض النووي الريبي عن الحمض النووي. لذا فإن كل ما تبقى بعد علاج RNAse هو DNA ، والعصابات التي اختفت هي RNA.

إذا قمت بعزل الأحماض النووية عن الكبد ، فسيكون الجزء الرئيسي من الحمض النووي هو الحمض النووي الجيني. ستكون مكونات الحمض النووي الريبي الرئيسية هي mRNA و rRNA. الحمض النووي الجينومي ضخم مقارنة بـ mRNA و rRNA. في الرحلان الكهربي للهلام للأحماض النووية ، تكون العصابات التي تتحرك أكثر هي أحماض نووية أصغر ، والعصابات التي تتحرك لمسافة أقل هي أحماض نووية أكبر. لذا فالشريط الموجود على اليسار في مثالك من المحتمل أن يكون DNA جينومي ، والشريط الموجود على اليمين هو mRNA أو rRNA. بعد هضم RNAse ، يجب أن يبقى الشريط الأيسر فقط ، وهو الإجابة أ.


يمكن أن ينثني الحمض النووي الريبي وبالتالي يهاجر أسرع من الحمض النووي. لذلك يظهر كالشريط الذي يتجه نحو الأمام الموجب. بعد علاج RNAse ستفقد تلك الفرقة. إذن الجواب هو أ


الاغاروز الكهربائي للهلام من الحمض النووي الريبي - (أغسطس / 13/2012)

هل يمكنك إرفاق صورة هلامية؟ بدون النظر إلى الجل الخاص بك ، أنا متأكد من أن النطاق فوق 28 ثانية كان شريط gDNA. إذا لم ترَ شيئًا بعد هضم DNase I ، فيجب أن يكون لديك تلوث RNase داخلي من إعداد RNA. حاول احتضان قسامة من إعداد الحمض النووي الريبي باستخدام المخزن المؤقت DNase I الذي يحتوي على 0.1 ملي مولار Ca2 + (دون إضافة DNase I) ، ثم قم بتشغيل الجل. أراهن أنك سترى أن 28s و 18s قد ولت وفرقة DNA باقية. خلاف ذلك ، قد يكون DNase I الخاص بك ملوثًا بـ RNases.

يعتبر استخراج الحمض النووي الريبي من الدم الكامل أمرًا صعبًا ، خاصةً الدم الكامل المجمد. تحقق من AquaPreserve الخاص بنا لاستخراج الحمض النووي الريبي في الدم ، فهو الكاشف الوحيد الذي يمكنه استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من الدم الكامل المجمد أو الطبقة العازلة التي يتم جمعها في مضادات التخثر الشائعة.

شكرا لردك.
هذه صورة جل. إحدى النقاط التي نسيت أن أذكرها هي أنه عندما أقوم بإجراء RT-PCR على cDNA المركب من DNase ، فقد عالجت الحمض النووي الريبي ، إنه يعمل. تم تصميم البرايمر الخاص بي من أجل تقاطع exon-exon.
مع تحياتي
'href = "http://www.protocol-online.org/forums/index.php؟app=core&module=attach§ion=attach&attach_rel_module=post&attach_id=4113" target = "_ blank">

نعم ، هذا هو gDNA في الأعلى. على الرغم من أنه لا يمكنك رؤية الحمض النووي الريبي في الهلام (تحتاج إلى حوالي 50 نانوغرام من الحمض النووي الريبي لرؤيته) بعد هضم DNase I ، يمكن أن يعمل تخليق cDNA و RT-PCR مع عدد قليل من نانوغرام من الحمض النووي الريبي. ولكن قد يكون غير متسق بسبب تتبع تلوث RNase. هل جربت احتضان تحضير الحمض النووي الريبي باستخدام المخزن المؤقت لـ DNase وحده لمعرفة ما إذا كنت ستفقد الحمض النووي الريبي؟ & # 39ll يخبرك ما إذا كان هناك تلوث RNase. حظا سعيدا.

مرحبًا AquaPlasmid.
لقد حضنت إعدادًا للـ RNA باستخدام محلول DNase المؤقت وحده. بعد التحميل على الهلام رأيت الرنا الريباسي 18 و 28 ثانية. للتأكد من تلوث Dnase الخاص بي ، عالجت أيضًا عنصر تحكم RNA (من مجموعة توليف cDNA التي قمت بفحصها مسبقًا على الجل) باستخدام Dnase ، هذه المرة لم يكن هناك شريط RNA مرة أخرى. هل تعتقد أن DNase الخاص بي ملوث بـ RNase وهل من الممكن استخدام مثبط RNase أثناء علاج DNase؟

نعم ، يبدو أن DNase I الخاص بك ملوث. ربما تحتاج إلى طلب واحدة جديدة من بائع آخر. Ambion & # 39s Turbo DNase و Qiagen & # 39s كلها جيدة جدًا. ما مقدار DNase الذي استخدمته في تفاعل 10-20 ul؟ أنت لا تحتاج إلى الكثير من DNase I ، فقط pipet فيه

0.5 ul DNase I ثم طرده بالكامل ، ثم الماصة بضع مرات لشطف طرفك في مزيج التفاعل يكفي. الكثير من DNase يمكنني أيضًا تقطيع الحمض النووي الريبي.


الرحلان الكهربائي ذو الخلية الواحدة للكشف عن الريبونوكليوتيدات الجينومية

يُمكِّن الرحلان الكهربائي للهلام أحادي الخلية أو مقايسة المذنب من قياس تلف الحمض النووي مثل الفواصل أحادية الخيط أو الخيط المزدوج على مستوى خلية واحدة. هنا ، نصف نوعًا مختلفًا من هذه الطريقة للكشف عن الريبونوكليوتيدات المضمنة في الحمض النووي الجيني. لفترة وجيزة ، يتم تضمين الخلايا في الاغاروز على شريحة مجهرية ، ويتم فصلها تحت ظروف عالية من الملح والقلوية ، ثم تخضع للعلاج في الموقع باستخدام E. coli RNase HII التي تقطع 5 'إلى ريبونوكليوتيد في سياق DNA مزدوج وبالتالي تحويل الجينوم الريبونوكليوتيدات في فواصل حبلا. بعد فك الحمض النووي الجيني باستخدام محلول قلوي عالي ، يتم إجراء الرحلان الكهربائي تحت ظروف قلوية معتدلة مما يؤدي إلى تكوين مذنبات بسبب هجرة الحمض النووي المجزأ نحو القطب الموجب. يمكن تصور مذنبات تلطيخ الذهب SYBR عن طريق الفحص المجهري الفلوري. في هذا الإعداد ، يعكس طول وشدة المذنبات المتكونة مستوى ريبونوكليوتيدات الجينوم الموجودة في خلية معينة.

الكلمات الدالة: التحلل القلوي مقايسة المذنب الجينومي DNA RNase H2 Ribonucleotides الرحلان الكهربي خلية واحدة.


مبدأ النشاف الشمالي

في النشاف الشمالي ، يتم عزل الحمض النووي الريبي الكلي أو الرنا المرسال من كائن حي ذي أهمية ، ثم يتم فصله بالكهرباء على هلام الاغاروز ، الذي يفصل الأجزاء على أساس الحجم. الخطوة التالية هي نقل الشظايا من الجل إلى مرشح النيتروسليلوز أو غشاء النايلون ، ويمكن إجراء ذلك بطريقة الشعيرات الدموية البسيطة.

ينتج عن النقل أو العلاج اللاحق تجميد شظايا الحمض النووي الريبي ، وبالتالي فإن الغشاء يحمل تكاثر شبه دائم لنمط النطاقات للجيل. يرتبط الحمض النووي الريبي بالغشاء بشكل لا رجعة فيه عن طريق الخبز عند درجة حرارة عالية (80 درجة مئوية) أو عن طريق التشابك بالأشعة فوق البنفسجية. للكشف عن تسلسل RNA معين ، يتم استخدام مسبار التهجين. مسبار التهجين عبارة عن حمض نووي قصير (100-500 نقطة في البوصة) واحد تقطعت به السبل إما مسبار DNA أو RNA الذي سيرتبط بقطعة مكملة من الحمض النووي الريبي.

يتم تمييز مجسات التهجين بعلامة (مشعة أو غير مشعة) بحيث يمكن اكتشافها بعد التهجين. في الكشف غير المشع ، يتم تمييز المسبار بالبيوتين أو الديجوكسيجينين. يتم غسل الغشاء لإزالة مسبار غير مرتبط بشكل محدد ويتم الكشف عن المسبار المهجن عن طريق معالجة الغشاء بإنزيم مترافق ، متبوعًا بحضانة بمحلول الركيزة الكروموجينيك. نتيجة لذلك ، يمكن رؤية شريط مرئي على الغشاء حيث يرتبط المسبار بعينة الحمض النووي الريبي.


خط رفيع عمودي من الآبار - اختبار رقاقة لكفاءة صوتنة - (22 فبراير 2014)

'href = "http://www.protocol-online.org/forums/index.php؟app=core&module=attach§ion=attach&attach_rel_module=post&attach_id=5439" target = "_ blank">مرحبًا ، أقوم بتشغيل 2٪ agarose gel electrophoresis لاختبار كفاءة الصوتنة (chIP assay). & # 160

مشكلتي هي أكثر من الرحلان الكهربائي للهلام نفسه - لماذا يوجد دائمًا خط رفيع رأسي يمتد من الآبار من هذا القبيل؟ هل يمكن أن يكون التلوث من نوع ما؟

ومع ذلك ، تم شراء سلمي حديثًا وأنا متأكد تمامًا من أنه غير ملوث. صبغة التحميل (6x) جديدة أيضًا. & # 160

بالنسبة للممر الأول ، استخدمت صبغة تحميل 2ul Ladder + 1 ul ، بينما استخدمت الممر الثاني سلم 2ul + صبغة 2ul.

بالنسبة لبقية عينات الحمض النووي ، أضفت صبغة 4ul + 20ul DNA ، وقمت بتحميل 20ul. & # 160

أي نصيحة هي محل تقدير! شكرا!

يبدو هذا كما لو كنت تصنع هلام الاغاروز بالماء بدلاً من المخزن المؤقت.

لقد صنعت الجل باستخدام 1X TBE Buffer. قم بتشغيله بنفس المخزن المؤقت أيضًا. & # 160

هل تخفف عينات السلم بحيث يكون تركيز الصبغة النهائي 1x؟

في أي منطقة عازلة تكون عيناتك قبل إضافة الصبغة؟

ما تراه يشبه تأثير الملح.

لم أفعل ذلك لسلمي ، ببساطة أضفت 2ul Ladder + 1 ul صبغة. لست متأكدًا من سبب عدم ظهور السلم جيدًا أيضًا (أول مسارين).

عيناتي موجودة في المخزن المؤقت لشطف رقاقة من مجموعة ميليبور شمال الولاية. أفترض أنها مكونة من 1٪ SDS و 0.1 مليون NaHCO3 مثل جميع الوصفات العازلة محلية الصنع.

أضفت 45ul من ChIP elution buffer إلى 5ul من الكروماتين الصوتي. ثم قمت بتسخين العينات لمدة 30 دقيقة باستخدام RNase A ، و 2 ساعة مع Proteinase K. هل هذا كافٍ للتخلص من تلوث RNA والبروتين؟ هل يمكن أن تكون هذه بسبب تلوث الحمض النووي الريبي والبروتين؟

"تأثير الملح" الذي أشرت إليه هو تأثير الوسائط الأيونية العالية نسبيًا على الرحلان الكهربائي.

قد تلاحظ أيضًا تأثيرًا ناتجًا عن تباين الأس الهيدروجيني في العينة ، والذي يحدث عادةً بسبب المخزن المؤقت الذي توجد فيه العينة يغمر المخزن المؤقت لصبغة التحميل.

حارات سلمك في التركيز النهائي لصبغة التحميل 2x و 3x على التوالي. يجب أن تخفف إلى صبغة تحميل 1x.

بالنسبة إلى علاج rnase و proteinase k ، إذا استخدمت الكمية المناسبة لكل منهما ، فيجب أن تكون أوقات الحضانة كافية. ولكن ، إلى أي درجة حرارة ساخنة؟ كيف توقف rnase؟ قد يظل نشطًا أثناء العلاج بالبروتيناز ك. كيف توقف بروتيناز ك؟

mdfenko في الثلاثاء 25 فبراير 12:36:45 2014 قال:

"تأثير الملح" الذي أشرت إليه هو تأثير الوسائط الأيونية العالية نسبيًا على الرحلان الكهربائي.

 

قد تلاحظ أيضًا تأثيرًا ناتجًا عن تباين الأس الهيدروجيني في العينة ، والذي يحدث عادةً بسبب المخزن المؤقت الذي توجد فيه العينة يغمر المخزن المؤقت لصبغة التحميل.

 

حارات سلمك في التركيز النهائي لصبغة التحميل 2x و 3x على التوالي. يجب أن تخفف إلى صبغة تحميل 1x.

 

بالنسبة إلى علاج rnase و proteinase k ، إذا استخدمت الكمية المناسبة لكل منهما ، فيجب أن تكون أوقات الحضانة كافية. ولكن ، إلى أي درجة حرارة ساخنة؟ كيف توقف rnase؟ قد يظل نشطًا أثناء العلاج بالبروتيناز ك. كيف توقف بروتيناز ك؟

لقد قمت بالتسخين باستخدام RNase A لمدة 30 دقيقة ، و Proteinase K 2 ساعة. أنا لا أوقف RNase ، بل أضيف بروتيناز K بعد 30 دقيقة. أنا لا أعرف كيف أوقف بروتيناز K أيضًا .. هل هناك شيء يجب أن أفعله؟ عادةً ما أقوم بالتحميل فورًا بعد الحضانة باستخدام بروتيناز K لمدة ساعتين.

حسنًا ، لقد قمت بتعديل تركيز السلم واتضح جيدًا! =)

بطريقة ما ، أعدت تشغيل نفس العينات ولم تظهر الخطوط بعد الآن! (الممرات على يسار السلم الأوسط).

من ناحية أخرى ، قمت بتسخين المزيد من الحمض النووي مع 2ul من 5M NaCl لمدة 4 ساعات ، تليها RNase A 37 درجة ، 30 دقيقة ، والبروتيناز K ، 62 درجة ، 2 ساعة. تُظهر الممرات الموجودة على اليمين نتائج تلك العينات. إنها في الواقع تبدو أقل وعدًا من الممر الأيسر ، وهو أمر غريب حقًا.

القوة الأيونية لعيناتك عالية جدًا. قد ترغب في محاولة ترسيب الحمض النووي (بعد معالجة rnase و proteinase k) ، وغسل الملح المتبقي وإعادة التعليق في المخزن المؤقت أو الماء (إذا كنت تستخدمه على الفور).


مجموعة فحص التلوث RNase (E3320)

يستخدم كل تفاعل قياسي 10 & ميكرول 1 & ميكرول من عينة الاختبار. يجب تخفيف عينة الاختبار في مخزن مؤقت لتخزين العينات إذا كانت شديدة التركيز (مثل مخزون الإنزيم). من المستحسن أن يتم تضمين تفاعل مع مادة مخففة للعينة (مثل محلول تخزين الإنزيم) بالإضافة إلى التحكم في المياه مع عينات الاختبار. الحد الأدنى من التفاعلات الموصى بها هي ثلاثة.

إذا تم استخدام مخزن مؤقت للتفاعل المخصص لاختبار العينة ، فاستبدل 10x NEBuffer 4 بمخزن رد فعل مخصص 10x. تأكد من تضمين الضوابط المناسبة. إذا كانت عينة الاختبار عبارة عن ماء ، فإننا نوصي باستبدال حجم الماء بعينة من الماء (8 ميكرول). تأكد من تضمين تفاعل تحكم مع الماء الخالي من RNase. قد تثبط العينات التي تحتوي على تركيز عالٍ جدًا من الملح أو المواد العضوية نشاط RNase وتتداخل مع PAGE.

يوصى بشدة بإعداد مزيج رئيسي مع كمية زائدة كافية. يوضح الجدول 1 مثالاً على إعداد مزيج رئيسي. بعد دمج المكونات ، امزجها جيدًا عن طريق الدوامة أو عن طريق تحريك الأنبوب عدة مرات ثم الدوران النبضي لفترة وجيزة. قسامة 9 وماكرول من ماستر ميكس لكل أنبوب ثم إضافة 1 ومايكروول من الضوابط المناسبة وعينات الاختبار إلى الأنابيب المعنية. اخلط جيدا.

يختلف وقت الحضانة حسب متطلبات الجودة لعينات الاختبار. وبشكل أكثر تحديدًا ، يعتمد ذلك على تطبيقات عينة الاختبار. على سبيل المثال ، إذا كان سيتم استخدام NTPs بتنسيق في المختبر النسخ عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة ، يجب احتضان NTPs لمدة 16 ساعة. نظرًا لأن الفحص يكون أكثر حساسية عند وجود المنظفات ، فإن فترة الحضانة لمدة ساعتين كافية للعينات التي تحتوي على المنظفات.

إذا كان من المحتمل أن ترتبط عينة الاختبار بمسبار RNA ، على سبيل المثال إنزيم النسخ العكسي MMLV ، يجب معالجة تفاعل الاختبار بـ 1 وميكرول من بروتيناز K في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق و 10 دقائق قبل تحليل الهلام. سيطلق هذا العلاج مسبار الحمض النووي الريبي المرتبط ويساعد في تحليل صورة الهلام. قد تختار معالجة جميع التفاعلات مع بروتيناز K عندما لا تكون متأكدًا مما إذا كانت عينات الاختبار ستلتزم بمسبار الحمض النووي الريبي. لا يتداخل علاج بروتيناز K مع الفحص. يوضح الشكل 1 أ (انظر صفحة المنتج) ميزة معالجة PK للتفاعلات مع العينات التي ترتبط بمسبار RNA (ردود الفعل 1 و 2) ولا يوجد فرق للتفاعلات مع العينات التي لا ترتبط بمسبار RNA (التحكم والتفاعل 3).

أضف 10 & microl من 2X RNA صبغة تحميل لكل رد فعل. تخلط جيدا وتدور النبض لفترة وجيزة. إذا لم تتمكن من متابعة تحليل الهلام ، فقم بتخزين العينات في درجة حرارة -20 درجة مئوية. يمكن تخزين العينات في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام على الأقل.

نوصي بتحليل ردود الفعل على هلام بولي أكريلاميد تغيير طبيعة (PAGE-Urea gel، 5 & ndash10٪). قبل التحميل ، تسخين العينات في 65 و ndash70 درجة مئوية لمدة 5 & ndash10 دقيقة ، وتدور النبض لفترة وجيزة. تحميل 10 وماكرول من كل عينة على هلام. قم بتشغيل الجل حتى يصبح لون البروموفينول الأزرق (الصبغة السريعة) حوالي 2 & ndash3 سم من قاع الجل. إذا كان الجل يمتد لمسافة طويلة ، فإن الملصق المجاني سوف يسيل من الجل. بالنسبة للجيل الصغير القياسي ، يكون وقت التشغيل حوالي 30 & ndash45 دقيقة.


تطبيقات الاغاروز الكهربائي للهلام

  • يساعد في تحديد العينات غير المعروفة.
  • إنها طريقة اختيار للتحقق من جودة ودقة الإجراءات الأخرى.
  • يتم استخدامه لفصل جزيئات الحمض النووي وهو مفيد أثناء إجراء معالجة الحمض النووي.
  • يتم استخدامه في دراسة الأشخاص وفقًا لتسلسل الحمض النووي المتميز لديهم.
  • يتم استخدامه للاستنساخ الجزيئي لبناء جزيئات الحمض النووي المؤتلف التي يتم دمجها في كائنات مختلفة لغرض التعديل الوراثي. للاستنساخ الجزيئي استخدامات مختلفة كما هو الحال في صناعة الأدوية ، على سبيل المثال إنتاج الأنسولين.
  • الاغاروز الكهربائي للهلام مفيد أيضا لبصمات الأصابع الجينية. يحدد الأفراد على أساس الكود الجيني. يتم استخدامه لتحقيقات الطب الشرعي واختبار النسب وعلم الأنساب.
  • إنه مفيد في فحص الاضطرابات الوراثية وتحديد تشوهات البروتين. (1 و 2 و 3 و 4 و 5)

مراجع

Drinnenberg I. A. وآخرون. رني في الخميرة في مهدها. علم 326, 544–550 (2009).

حريق أ وآخرون. تدخل وراثي قوي ومحدد بواسطة RNA مزدوج الشريطة في Caenorhabditis elegans. طبيعة سجية 391, 806–811 (1998).

هاملتون ، A. J. & amp Baulcombe ، D.C. نوع من الحمض النووي الريبي الصغير المضاد للحساسية في إسكات الجينات بعد النسخ في النباتات. علم 286, 950–952 (1999).

Imig J. et al. يكشف التقاط miR-CLIP لهدف ميرنا عن تفاعل lincRNA H19-miR-106a. نات. تشيم. بيول. 11, 107–114 (2015).

البشير س.م وآخرون. الازدواجية من 21 نيوكليوتيد RNAs تتوسط تدخل الحمض النووي الريبي في خلايا الثدييات المستزرعة. طبيعة سجية 411, 494–498 (2001).

شي واي Mammalian RNAi للجماهير. اتجاهات الجينات. 19, 9–12 (2003).

روجر ، إيه جيه ، مونوز جوميز ، إس إيه ، وأمبير كاميكاوا ، ر. أصل الميتوكوندريا وتنوعها. بالعملة. بيول. 27، R1177 – R1192 (2017).

ليو جيه وآخرون. Argonaute2 هو المحرك الحفاز للثدييات RNAi. علم 305, 1437–1441 (2004).

Zhang X. R. وآخرون. يعزز MicroRNA مباشرة ترجمة الميتوكوندريا أثناء تمايز العضلات. زنزانة 158, 607–619 (2014).

كرين ب ت وآخرون. قد تلعب MicroRNAs المحددة في الميتوكوندريا عالية النقاء المشتقة من الكبد دورًا في موت الخلايا المبرمج. RNA بيول. 6, 65–72 (2009).

كوبمان ، دبليو جيه إتش ، ديستلمير ، إف ، سميتينك ، جيه إيه إم وأمبير ويليمز ، بي إتش جي إم ، طفرات أوكسفوس والتنكس العصبي. EMBO J. 32, 9–29 (2013).

Ojala ، D. ، Montoya ، J. & amp Attardi ، G. نموذج ترقيم الحمض النووي الريبي لمعالجة الحمض النووي الريبي في الميتوكوندريا البشرية. طبيعة سجية 290, 470–474 (1981).

Moulin، C.، Caumont-Sarcos، A. & amp Ieva، R. استيراد تسلسل وجود الميتوكوندريا: مقابض تنظيمية متعددة تعمل على ضبط التكوين الحيوي للميتوكوندريا والتوازن. بيوكيم. بيوفيز. اكتا مول. دقة الخلية. 1866, 930–944 (2019).

Jeandard D. et al. استيراد الحمض النووي الريبي غير المشفر إلى الميتوكوندريا البشرية: مراجعة نقدية والنهج الناشئة. الخلايا 8, 286 (2019).

إسحاق ، آر إس ، ماكشين ، إي وأمبير تشرشمان ، إل إس المستويات المتعددة من تنظيم الميتو نووي. Annu. القس جينيه. 52, 511–533 (2018).

شنايدر أ. الجوانب الفريدة للتكوين الحيوي للميتوكوندريا في المثقبيات. كثافة العمليات J. باراسيتول. 31, 1403–1415 (2001).

Schneider A. استيراد الحمض الريبي النووي النقال للميتوكوندريا وعواقبه على ترجمة الميتوكوندريا. Annu. القس Biochem. 80, 1033–1053 (2011).

هولزمان ج وآخرون. RNase P بدون RNA: تحديد وإعادة التكوين الوظيفي لإنزيم معالجة الحمض النووي الريبي المتقدري البشري. زنزانة 135, 462–474 (2008).

براون أ وآخرون. هيكل الوحدة الفرعية الريبوسومية الكبيرة من الميتوكوندريا البشرية. علم 346, 718–722 (2014).

Kiss، T. & amp Filipowicz، W. دليل ضد موقع الميتوكوندريا من 7-2 / MRP RNA في خلايا الثدييات. زنزانة 70, 11–16 (1992).

داس س وآخرون. ينظم الحمض النووي الريبي المرسال النووي جينوم الميتوكوندريا في القلب. سيرك. الدقة. 110, 1596–1603 (2012).

Mahapatra، S.، Ghosh، T. & amp Adhya، S. استيراد رنا صغيرة إلى ميتوكوندريا الليشمانيا في المختبر. الدقة الأحماض النووية. 22, 3381–3386 (1994).

روبيو م. وآخرون. تمتلك الميتوكوندريا الثديية القدرة الفطرية على استيراد الحمض الريبي النووي النقال بواسطة آلية تختلف عن استيراد البروتين. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية. 105, 9186–9191 (2008).

Hoogewijs K. et al. ClickIn: بروتوكول مرن للقياس الكمي لامتصاص الميتوكوندريا لمشتقات النواة. التركيز على الواجهة 7, 20160117 (2017).

لوجان إيه وآخرون. تقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا في الخلايا وفي الجسم الحي باستخدام كيمياء النقر المستهدفة وقياس الطيف الكتلي. ميتاب الخلية. 23, 379–385 (2016).

وانغ واي وآخرون. هيكل مجمع إسكات الأرجونوت مع دليل DNA يحتوي على بذرة و RNA مستهدف مزدوج. طبيعة سجية 456, 921–926 (2008).

McKee ، E. E. ، Ferguson ، M. ، Bentley ، A. T. & amp Marks ، T. A. تثبيط تخليق بروتين الميتوكوندريا في الثدييات بواسطة أوكسازوليدينون. وكلاء مضادات الميكروبات Chemother. 50, 2042–2049 (2006).

ستراود دي إيه وآخرون. الوحدات الفرعية الملحقة جزء لا يتجزأ من تجميع ووظيفة مجمع الميتوكوندريا البشري I. طبيعة سجية 538, 123–126 (2016).

كيهرين ك وآخرون. تنظيم التعبير الجيني للميتوكوندريا في مجموعتين متميزتين تحتويان على الريبوسوم. مندوب الخلية. 10, 843–853 (2015).

Bogenhagen، D.F، Martin، D.W & amp Koller، A. تحدث الخطوات الأولية في معالجة الحمض النووي الريبي وتجميع الريبوسوم في نوكليويد الحمض النووي للميتوكوندريا. ميتاب الخلية. 19, 618–629 (2014).

راكهام و. وآخرون. مطلوب معالجة الحمض النووي الريبي الهرمي لتجميع الريبوسوم الميتوكوندريا. مندوب الخلية. 16, 1874–1890 (2016).

تايلور ، R.W. & amp Turnbull ، D. M. طفرات الحمض النووي للميتوكوندريا في الأمراض البشرية. نات. القس جينيه. 6, 389–402 (2005).

جو جيه وآخرون. بنية الجهاز التنفسي للثدييات. طبيعة سجية 537, 639–643 (2016).

Wu، M.، Gu، J.، Guo، R.، Huang، Y. & amp Yang، M. هيكل مجمع الثدييات التنفسي الفائق I1III2IV1. زنزانة 167, 1598–1609 (2016).

Guo، R.، Zong، S.، Wu، M.، Gu، J. & amp Yang، M.2ثالثا2رابعا2. زنزانة 170, 1247–1257 (2017).

تيرانتي ف وآخرون. تؤدي طفرة جديدة في تغيير الإطارات لجين mtDNA COIII إلى ضعف تجميع السيتوكروم سي أوكسيديز في مريض مصاب بمتلازمة ليه الشبيهة. همم. مول. جينيه. 9, 2733–2742 (2000).

لي واي وآخرون. يحافظ المركب المركب IV على استقرار ونشاط المركب I في الميتوكوندريا الثديية. J. بيول. تشيم. 282, 17557–17562 (2007).

Rahman S. et al. تؤدي الطفرة الخاطئة في الوحدة الفرعية الثانية من السيتوكروم أوكسيديز إلى خلل في التجميع والاعتلال العضلي. أكون. جيه هوم. جينيه. 65, 1030–1039 (1999).

هورنج دو إتش تي وآخرون. الطفرات غير المنطقية في الوحدة الفرعية COX1 تضعف استقرار مجمعات سلسلة الجهاز التنفسي بدلاً من تجميعها. EMBO J. 31, 1293–1307 (2012).

وانج جي وآخرون. ينظم PNPASE استيراد الحمض النووي الريبي إلى الميتوكوندريا. زنزانة 142, 456–467 (2010).

نوه جي إتش وآخرون. يعدل HuR و GRSF1 التصدير النووي وتوطين الميتوكوندريا لـ lncRNA RMRP. تطوير الجينات. 30, 1224–1239 (2016).

Wiedemann، N. & amp Pfanner، N. ماكينات الميتوكوندريا لاستيراد البروتين وتجميعه. Annu. القس Biochem. 86, 685–714 (2017).

Schinzel A.C et al. Cyclophilin D هو أحد مكونات انتقال نفاذية الميتوكوندريا ويتوسط موت الخلايا العصبية بعد نقص تروية الدماغ البؤري. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية. 102, 12005–12010 (2005).

Halestrap A. P. ما هو مسام انتقال نفاذية الميتوكوندريا؟ جيه مول. خلية كارديول. 46, 821–831 (2009).

Dhir A. et al. يطلق الحمض النووي الريبي المتقدري مزدوج الشريطة إشارات مضادة للفيروسات لدى البشر. طبيعة سجية 560, 238–242 (2018).

لي هـ وآخرون. MicroRNA-21 يخفض ضغط الدم لدى الفئران التي تعاني من ارتفاع ضغط الدم تلقائيًا عن طريق تنظيم ترجمة الميتوكوندريا. الدوران 134, 734–751 (2016).

Frezza، C.، Cipolat، S. & amp Scorrano، L. نات. بروتوك. 2, 287–295 (2007).

Sasarman، F. & amp Shoubridge، E. A. وضع العلامات المشعة على منتجات ترجمة الميتوكوندريا في الخلايا المستنبتة. طرق مول. بيول. 837, 207–217 (2012).

Leary S.C. الأزرق الأصلي بولي أكريلاميد هلام الكهربائي: أداة تشخيصية قوية للكشف عن عيوب التجميع في المجمعات الإنزيمية من الفسفرة المؤكسدة. طرق مول. بيول. 837, 195–206 (2012).

Khvorostov، I.، Zhang، J. & amp Teitell، M. البحث عن نشاط معقد الميتوكوندريا في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. J. فيس. إكسب. 17, 724 (2008).

جاو واي وآخرون. ينظم عامل استطالة الثدييات 4 ترجمة الميتوكوندريا الضرورية لتكوين الحيوانات المنوية. نات. هيكل. مول. بيول. 23, 441–449 (2016).

خاشو م وآخرون. تؤثر ديناميات الميتوكوندريا على هوية الخلايا الجذعية وقرارات المصير من خلال تنظيم برنامج النسخ النووي. الخلية الجذعية للخلايا 19, 232–247 (2016).


الرحلان الكهربائي للهلام بعد العلاج بالـ RNAse - علم الأحياء

ال مقص قلم رصاص فضاء scissorscutting readingglasses كتاب جرس شمعة telephonesolid telhandsetcirc envelopeback envelopefront mailboxflagdwn mailboxflagup mailbxopnflgup mailbxopnflgdwn مجلد folderopen filetalltext1 filetalltext filetalltext3 filecabinet الساعة الرملية لوحة المفاتيح mouse2button الحبر الكمبيوتر القرص الصلب floppy3 floppy5 tapereel الكتابة بخط اليد handwriteleft handv handok thumbup thumbdown handptleft handptright handptup handptdwn handhalt smileface neutralface frownface قنبلة skullcrossbones العلم راية أشعة الشمس الطائرة قطرة ندفة الثلج xmarkbld checkbld boxxmarkbld box checkbld crossoutline crossshadow crossceltic crossmaltese starofdavid crescentstar yinyang om wheel aries برج الثور الجوزاء دينار quotedblrtbld ردة rosettesolid budleafne budleafnw budleafsw budleafse vineleafboldne vineleafboldnw vineleafboldsw vineleafboldse الواضح قيادة الهروب zerosans onesans twosans threesans foursans fivesans sixsans sevensans eightsans ninesans tensans zerosansinv onesansinv twosansinv threesansinv foursansinv fivesansinv sixsansinv sevensansinv eightsansinv ninesansinv tensansinv CIRCLE2 circle4 circle6 ring2 ring4 ring6 ringbutton2 استهداف circleshadowup circleshadowdwn square2 square4 square6 box2 box3 box4 boxshadowup boxshadowdwn rhombus4 rhombus6 lozenge4 lozenge6 tristar2 crosstar2 pentastar2 hexstar2 octastar2 dodecastar3 octastar4 registersquare registercircle cuspopen cuspopen1 xrhombus الاستعلام circlestar starshadow oneoclock twooclock threeoclock fouroclock fiveoclock sixoclock sevenoclock eightoclock nineoclock tenoclock elevenoclock twelveoclock arrowdwnleft1 arrowdwnrt1 arrowupleft1 arrowuprt1 arrowleftup1 arrowrtup1 arrowleftdwn1 arrowrtdwn1 quiltsquare2 quiltsquare2inv leafccwsw leafccwnw leafccwse leafccwne leafnw leafsw leafne leafse deleteleft deleteright head2left head2right head2up head2down circleleft circleright circleup circledown barb2left barb2right barb2up barb2down barb2nw barb2ne barb2sw barb2se barb4left barb4right barb4up barb4down barb4nw barb4ne barb4sw barb4se مشرق مشرق BUP bdown bleftright bupdown BNW BNE BSW مرض جنون البقر bdash1 bdash2 windowslogo @ FF @ H 6 H2 H2 H2 H2 H2 H2 H2 H2 H2 H2 I H2 H H2 G H2 B H2 @ H2 > H2 CX !

! + Y # B #B endstream endobj 29 0 obj> / Width 2250 / BitsPerComponent 1 / Length 782 >> Stream & ، | x xg ͂ Tr E.

٪ Y u څ BB D & v (yt f `4 U 3 4 @ nw l B "# B k endstream endobj 26 0 obj> / Width 2250 / BitsPerComponent 1 / Length 157 >> Stream & ، ٪ ؟ O > / العرض 2250 / BitsPerComponent 1 / Length 241 >> Stream & J s K ` C0 & _ > N i < 9S a! (؟ O


كتاب الأسلوب

الاغاروز الكهربائي للهلام هو الطريقة الأسهل والأكثر شيوعًا لفصل وتحليل الحمض النووي. قد يكون الغرض من الجل هو النظر إلى الحمض النووي ، لتحديد كميته أو عزل شريط معين. يتم تصوير الحمض النووي في الهلام عن طريق إضافة بروميد إيثيديوم ، وهو مطفر أو أصباغ مملوكة ملكية أقل سمية مثل GelRed و GelGreen و SYBR Safe. يرتبط بروميد الإيثيديوم والأصباغ المسجلة الملكية بالحمض النووي وهي فلورية ، مما يعني أنها تمتص ضوء الأشعة فوق البنفسجية غير المرئي وتنقل الطاقة كضوء مرئي.

ما نسبة الجل؟

معظم المواد الهلامية الاغاروز مصنوعة بين 0.7٪ و 2٪. سيظهر هلام 0.7٪ فصلًا جيدًا (دقة) لشظايا الحمض النووي الكبيرة (5 & # 821110 كيلو بايت) وسيظهر هلام 2٪ دقة جيدة للأجزاء الصغيرة (0.2 & # 82111 كيلو بايت). يرتفع بعض الأشخاص بنسبة تصل إلى 3٪ لفصل الأجزاء الصغيرة جدًا ولكن هلام بولي أكريلاميد العمودي يكون أكثر ملاءمة في هذه الحالة. المواد الهلامية منخفضة النسبة ضعيفة جدًا وقد تنكسر عند محاولة رفعها. غالبًا ما تكون المواد الهلامية ذات النسبة العالية هشة ولا يتم تثبيتها بالتساوي. أنا عادة أصنع 1٪ من المواد الهلامية.

أي خزان جل؟

المواد الهلامية الصغيرة مقاس 8x10 سم (minigels) تحظى بشعبية كبيرة وتعطي صورًا جيدة. تستخدم المواد الهلامية الكبيرة في تطبيقات مثل النشاف الجنوبي والشمالي. حجم الاغاروز المطلوب للمينيجل حوالي 30 & # 821150 مل ، للهلام الأكبر قد يكون 250 مل. تفترض هذه الطريقة أنك تصنع جلًا صغيرًا.

كم يجب تحميل الحمض النووي؟

السؤال الكبير. ربما تقوم بإعداد هلام تحليلي لمجرد إلقاء نظرة على الحمض النووي الخاص بك. بدلاً من ذلك ، قد تقوم بإعداد هلام تحضيري لفصل جزء من الحمض النووي قبل قطعه من الجل لمزيد من العلاج. في كلتا الحالتين ، تريد أن تكون قادرًا على رؤية عصابات الحمض النووي تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في هلام ملطخ بالإيثيديوم بروميد. عادةً ما يكون الشريط مرئيًا بسهولة إذا كان يحتوي على حوالي 20 نانوغرام من الحمض النووي.

الآن فكر في مثال. افترض أنك تهضم بلازميدًا يتكون من 3 كيلو بايت من المتجه و 2 كيلو بايت من الإدخال. أنت تستخدم EcoRI (إنزيم تقييد شائع) وتتوقع أن ترى ثلاثة نطاقات: المتجه الخطي (3 كيلو بايت) ، ونهاية الإدخال 5 بوصة (0.5 كيلو بايت) ونهاية الإدخال (1.5 كيلو بايت). لكي ترى أصغر نطاق (0.5 كيلو بايت) ، فأنت تريده أن يحتوي على 20 نانوغرام على الأقل من الحمض النووي. أصغر نطاق هو 1/10 من حجم البلازميد غير المقطوع. لذلك تحتاج إلى قطع 10x20 نانوغرام ، أي 200 نانوغرام من الحمض النووي (0.2 & # 181 جم). ثم ستحتوي نطاقاتك الثلاثة على 120 نانوغرام و 20 نانوغرام و 60 نانوغرام من الحمض النووي على التوالي. ستكون الأشرطة الثلاثة مرئية بوضوح على الجل وستكون الفرقة الأكبر ست مرات أكثر سطوعًا من أصغر فرقة.

تخيل الآن قطع البلازميد نفسه باستخدام BamHI (إنزيم تقييد شائع آخر) وأن BamHI يقطع البلازميد مرة واحدة فقط ، ليخطوه. إذا هضمت 200 نانوغرام من الحمض النووي في هذه الحالة ، فستحتوي الحزمة على 200 نانوغرام من الحمض النووي وستكون مشرقة جدًا.

الكثير من الحمض النووي تحميلها على مادة هلامية شيء سيء. يبدو أن الفرقة تعمل بسرعة (مما يعني أنها أصغر مما هي عليه بالفعل) وفي الحالات القصوى يمكن أن تفسد المجال الكهربائي للنطاقات الأخرى ، مما يجعلها تظهر بالحجم الخطأ أيضًا.

القليل من الحمض النووي هي فقط مشكلة من حيث أنك لن تكون قادرًا على رؤية أصغر الفرق الموسيقية لأنها باهتة جدًا.

بعد قولي هذا كله ، فإن المواد الهلامية للحمض النووي متسامحة ، وستعطي مجموعة واسعة من أحمال الحمض النووي نتائج مقبولة. عادةً ما أستوعب وتحميل 2 & # 82114 & # 181L من 50 & # 181L التي تم الحصول عليها من مجموعة miniprep. بالنسبة لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يعتمد ذلك على تفاعل البوليميراز المتسلسل ولكن في التطبيقات الروتينية ، يجب أن تكون 10 & # 821120 & # 181L كافية لرؤية المنتج على الجل.

أي مشط؟

هذا يعتمد على حجم الحمض النووي الذي تقوم بتحميله وعدد العينات. الأمشاط التي بها العديد من الأسنان الصغيرة قد تحمل 10 & # 181 لتر. هذا ليس جيدًا إذا كنت تريد تحميل 20 & # 181L من ملخص التقييد بالإضافة إلى 5 & # 181L من مخزن التحميل المؤقت. عند تحديد ما إذا كان المشط يحتوي على أسنان كافية ، تذكر أنك بحاجة إلى تحميل ممر واحد على الأقل ، ويفضل أن يكون اثنان.

صنع الجل (جل 1٪ ، حجم 50 مل)

تزن 0.5 جرام من الاغاروز في دورق مخروطي سعة 250 مل. إضافة 50 مل 0.5xTBE ، دوامة للخلط.

من الجيد استخدام وعاء كبير ، طالما أنه يناسب الميكروويف ، لأن الاغاروز يغلي بسهولة.

الميكروويف لحوالي 1 دقيقة لإذابة الاغاروز.

يمكن أن يغلي محلول الاغاروز بسهولة شديدة لذا استمر في فحصه. من الجيد إيقافه بعد 45 ثانية وإعطائه دوامة. يمكن أن تصبح شديدة السخونة ولا تغلي حتى تخرجها ثم تغلي على يديك. وبالتالي ارتداء القفازات وامسكها بطول الذراعين. يمكنك استخدام موقد بنسن بدلاً من الميكروويف - فقط تذكر أن تستمر في مشاهدته.

اتركه ليبرد على المقعد لمدة 5 دقائق إلى حوالي 60 درجة مئوية (فقط حار جدًا بحيث لا يمكن الإمساك به بأيدي عارية).

إذا اضطررت إلى غليها لفترة طويلة لإذابة الاغاروز ، فربما تكون قد فقدت بعض الماء في بخار الماء. يمكنك وزن الدورق قبل وبعد التسخين وإضافة القليل من الماء المقطر لتعويض هذا الحجم المفقود. أثناء تبريد الاغاروز ، قم بإعداد خزان الجل جاهزًا ، على سطح مستو.

أضف 1 & # 181 لتر من بروميد الإيثيديوم (10 مجم / مل) وقم بخلط المكونات

السبب في السماح للأغاروز بالتبريد قليلاً قبل هذه الخطوة هو تقليل إنتاج بخار بروميد الإيثيديوم. إيثيديوم بروميد هو مطفر ويجب التعامل معها بحذر شديد. تخلص من الطرف الملوث في حاوية نفايات بروميد الإيثيديوم المخصصة. يتكون محلول بروميد الإيثيديوم 10 & nbspmg / mL باستخدام أقراص (لتجنب وزن المسحوق) ويتم تخزينه في 4 & # 176 درجة مئوية في الظلام مع ملصقات TOXIC عليه.

هناك بدائل لاستخدام بروميد الإيثيديوم السام والمسبب للطفرات:

صب الجل ببطء في الخزان. ادفع أي فقاعات بعيدًا إلى الجانب باستخدام طرف يمكن التخلص منه. أدخل المشط وتأكد من وضعه بشكل صحيح.

فائدة السكب البطيء هي أن معظم الفقاعات تبقى في القارورة. اشطف القارورة على الفور.

اتركيه لمدة 30 دقيقة على الأقل ، ويفضل أن يكون ذلك لمدة ساعة ، مع الغطاء إذا أمكن.

قد يبدو الجل مضبوطًا في وقت أقرب بكثير ، لكن تشغيل الحمض النووي في مادة هلامية في وقت قريب جدًا يمكن أن يعطي نتائج سيئة المظهر مع عصابات منتشرة ملطخة.

صب 0.5x TBE العازلة في خزان الهلام لغمر الجل حتى 2 & # 82115 ملم عمق. هذا هو المخزن المؤقت قيد التشغيل.

يجب عليك استخدام نفس المخزن المؤقت في هذه المرحلة الذي استخدمته لصنع الجل. بمعنى آخر. إذا كنت تستخدم 0.6xTBE في الجل ، فاستخدم 0.6xTBE لمخزن التشغيل. تذكر إزالة مُشكِّلات الهلام المعدنية إذا كان خزان الجل يستخدمها.

تجهيز العينات

نقل كمية مناسبة من كل عينة إلى أنبوب microfuge جديد.

قد يكون 10 & # 181L من تفاعل 50 & # 181L PCR أو 5 & # 181L من 20 & # 181L هضم إنزيم مقيد. إذا كنت تقوم بتحميل 20 & # 181L بالكامل من تفاعل 20 & # 181L PCR أو هضم الإنزيم (كما أفعل غالبًا) ، فلا داعي لاستخدام أنابيب جديدة ، ما عليك سوى إضافة مخزن التحميل المؤقت في أنابيب PCR. اكتب في كتابك المختبر الترتيب المادي للأنابيب حتى تتمكن من تحديد الممرات على صورة الهلام.

أضف كمية مناسبة من المخزن المؤقت للتحميل في كل أنبوب واترك الطرف في الأنبوب.

أضف 0.2 حجمًا من المخزن المؤقت للتحميل ، على سبيل المثال. 2 & # 181L في عينة 10 & # 181L. سيتم استخدام الحافة مرة أخرى لتحميل الجل.

أقوم بتخزين علاماتي جاهزة ممزوجة مع مخزن التحميل المؤقت في 4 & # 176 درجة مئوية. أعلم أنه يجب تحميل 2 & # 181L ومقدار الحمض النووي في كل فرقة. انظر أدناه لمزيد من المعلومات حول هذا.
تجنب استخدام الآبار النهائية إذا أمكن. For example, If you have 12 samples and 2 markers then you will use 14 lanes in total. If your comb formed 18 wells then you will not be using 4 wells. It is best to not use the outer wells because they are the most likely to run aberrantly.

Continue loading the samples and finish of with a final lane of marker

I load gels from right to left with the gel oriented such that the wells are close to the edge of the bench, and the DNA will migrate away from the edge of the bench. This is because gels are published, by convention, as if the wells were at the top and the DNA had run down the page.

Close the gel tank, switch on the power-source and run the gel at 5 V/cm.

For example, if the electrodes are 10 cm apart then run the gel at 50 V. It is fine to run the gel slower than this but do not run any faster. Above 5 V/cm the agarose may heat up and begin to melt with disastrous effects on your gel's resolution. Some people run the gel slowly at first (eg. 2 V/cm for 10 minutes) to allow the DNA to move into the gel slowly and evenly, and then speed up the gel later. This may give better resolution. It is OK to run gels overnight at very low voltages, eg. 0.25𔂾.5 V/cm, if you want to go home at 11 O'clock already.

Check that a current is flowing

You can check this on the power-source, the milliamps should be in the same ball-park as the voltage, but the the best way is to look at the electrodes and check that they are evolving gas (ie. bubbles). If not then check the connections, that the power-source is plugged in etc.etc. This has been known to happen if people use water instead of running buffer.

Monitor the progress of the gel by reference to the marker dye.

Stop the gel when the bromophenol blue has run 3/4 the length of the gel.

Switch off and unplug the gel tank and carry the gel (in its holder if possible) to the dark-room to look at on the UV light-box.

Some gel holders are not UV transparent so you have to carefully place the gel onto the glass surface of the light-box. UV is مسرطنة and must not be allowed to shine on naked skin or eyes. So wear face protection, gloves and long sleeves.

The loading buffer gives colour and density to the sample to make it easy to load into the wells. Also, the dyes are negatively charged in neutral buffers and thus move in the same direction as the DNA during electrophoresis. This allows you to monitor the progress of the gel. The most common dyes are bromophenol blue (Sigma B8026) and xylene cyanol (Sigma X4126). Density is provided by glycerol or sucrose.

The exact amount of dye is not important
Store at 4°C to avoid mould growing in the sucrose. 10 mL of loading buffer will last for years.

Bromophenol blue migrates at a rate equivalent to 200� bp DNA. If you want to see fragments anywhere near this size then use the other dye because the bromophenol blue will obscure the visibility of the small fragments. Xylene cyanol migrates at approximately 4kb equivalence. So do not use this if you want to visualise fragments of 4 kb.

There are lots of different kinds of DNA size markers. In the old days the cheapest defined DNA was from bacteriophage so alot of markers are phage DNA cut with restriction enzymes. Many of these are still very popular eg, lambda HindIII, lambda PstI, PhiX174 HaeIII. These give bands with known sizes but the sizes are arbitrary. Choose a marker with good resolution for the fragment size you expect to see in you sample lanes. For example, for tiny PCR products you might choose PhiX174 HaeIII but for 6kb fragments you would choose lambda HindIII. More recently, companies have started producing ladder markers with bands at defined intervals, eg. 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 kb and so on up to 10 kb. If you know the total amount of DNA loaded into a marker lane, and you know the sizes of all the bands, you can calculate the amount of DNA in each band visible on the gel. This can be very useful for quantifying the amount of DNA in your sample bands by comparison with the marker bands. It is good to load two markers lanes, flanking the samples. Lots of companies sell DNA size markers. It pays to shop around for the cheapest. Often the local kitchen-sink biotech company sells excellent markers.

TBE stands for Tris Borate EDTA.

People also use TAE (Tris Acetate EDTA). Make up a 10x stock using cheap reagents. Do not use expensive 'analytical grade' reagents. Cheap Tris base and boric acid can be bought in bulk.

Dissolve the ingredients in 1.9 L of distilled water. pH to about 8.3 using NaOH and make up to 2 L.


RNase Contamination Assay Kit (E3320)

Each 10 µl standard reaction uses 1 µl of test sample. The test sample should be diluted in sample storage buffer if it is very concentrated (e.g. enzyme stock). It is recommended that a reaction with a sample diluent (e.g. enzyme storage buffer) as well as a water control should be included along with test samples. The recommended minimal reactions are three.

If a custom reaction buffer is used for sample testing, replace 10X NEBuffer 4 with 10X custom reaction buffer. Be sure to include appropriate controls. If the test sample is water, we recommend replacing the water volume with sample water (8 µl). Be sure to include a control reaction with RNase-free water. Samples containing very high concentration of salt or organics may inhibit RNase activity and interfere with PAGE.

It is highly recommended that a master mix with enough overage is prepared. Table 1 shows an example of a master mix preparation. After combining the components, mix them thoroughly by vortexing or by flicking the tube several times and then pulse-spin briefly. Aliquot 9 µl of master mix to each tube and then add 1 µl of appropriate controls and test samples to the respective tubes. اخلط جيدا.

Incubation time varies depending on the quality requirements of test samples. More specifically, it depends on the applications of the test sample. For example, if the NTPs will be used in في المختبر transcription at 37°C for 16 hours, the NTPs should be incubated for 16 hours. Because the assay is more sensitive when detergent is present, 2 hour incubation is sufficient for samples containing detergent.

If the test sample can potentially bind to the RNA probe, e.g. MMLV reverse transcriptase, the test reaction should be treated with 1 µl of proteinase K at room temperature for 5&ndash10 minutes before gel analysis. This treatment will release the bound RNA probe and help with gel image analysis. You may choose to treat all of the reactions with proteinase K when you are unsure whether the test samples will bind to the RNA probe. Proteinase K treatment does not interfere with the assay. Figure 1A (see product page) shows the advantage of PK treatment of reactions with samples that bind to the RNA probe (reactions 1 and 2) and no difference for reactions with samples that do not bind to RNA probe (control and reaction 3).

Add 10 µl of 2X RNA loading dye to each reaction. Mix thoroughly and pulse-spin briefly. If you are unable to proceed with gel analysis, store the samples at -20°C. Samples can be stored at -20°C for at least three days.

We recommend analyzing the reactions on a denaturing polyacrylamide gel (PAGE-Urea gel, 5&ndash10%). Before loading, heat the samples at 65&ndash70°C for 5&ndash10 min, pulse-spin briefly. Load 10 µl of each sample onto gel. Run the gel until the bromophenol blue (the fast dye) is approximately 2&ndash3 cm from the bottom of the gel. If the gel runs too far, the free label will run off the gel. For a standard mini-gel, the running time is about 30&ndash45 min.


شاهد الفيديو: Elettroforesi su gel (قد 2022).


تعليقات:

  1. Diramar

    أؤكد. كان معي أيضا. دعونا نناقش هذه المسألة.

  2. Kazradal

    في رأيي لم تكن على حق. أنا مطمئن. اكتب لي في PM.

  3. Donnell

    شكرًا على المدونة ، تم كل شيء بكفاءة للغاية. ومع ذلك ، فإن المستقلة أفضل من LiveJournal وغيرها.

  4. Werian

    أعتقد أنك مخطئ. أقترح ذلك لمناقشة. اكتب لي في رئيس الوزراء ، وسوف نتواصل.



اكتب رسالة