معلومة

1.8: تنقية الحمض النووي الريبي لمستشعر السموم المتحولة ykkCD وتقييم نقاوته باستخدام تغيير طبيعة الصفحة وطيف الأشعة فوق البنفسجية - علم الأحياء

1.8: تنقية الحمض النووي الريبي لمستشعر السموم المتحولة ykkCD وتقييم نقاوته باستخدام تغيير طبيعة الصفحة وطيف الأشعة فوق البنفسجية - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

8.1 هدف التعلم

الغرض من هذا المعمل هو تعلم كيفية تنقية عينات الحمض النووي الريبي وتقييم نقاوتها باستخدام التحليل الكهربائي للهلام البولي أكريلاميد (urea PAGE). توليف جزيئات الحمض النووي الريبي في المختبر يتم تنقية النسخ لإزالة بوليميريز الحمض النووي الريبي ، قالب الحمض النووي والنيوكليوتيدات غير المستخدمة (NTPs). يجب تنقية RNA لمستشعر السموم الطافرة للأسباب التالية: (1) يمكن أن يتداخل قالب الحمض النووي والنيوكليوتيدات غير المستخدمة مع التحديد الدقيق لتركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية ، لأن هذه المركبات تمتص أيضًا ضوء الأشعة فوق البنفسجية عند 260 نانومتر. (2) قد تتداخل بوليميراز RNA ومخزن النسخ المؤقت و NTPs غير المستخدمة مع فحوصات الربط اللاحقة.

8.2 مخطط انسيابي للمشروع الصغير

تسلط الكتلة الغامقة في المخطط الانسيابي أدناه الضوء على دور التجربة الحالية في المشروع الصغير.

8.3 طرق تنقية الحمض النووي الريبي

في المختبر يمكن تنقية الحمض النووي الريبي المركب باستخدام طرق مختلفة: تغيير طبيعة هلام البولي أكريلاميد الكهربائي (تغيير طبيعة الصفحة) ، واستخراج الفينول / الكلوروفورم أو تنقية العمود. يتم توفير وصف موجز لكل طريقة أدناه.

8.4 تغيير طبيعة الصفحة

يفصل تغيير طبيعة PAGE جزيئات الحمض النووي الريبي عن طريق وزنها الجزيئي (الشكل 8.1 أ). تستخدم هذه الطريقة لتنقية الحمض النووي الريبي وتقييم نقاء الحمض النووي الريبي. في الحالة الأخيرة ، يتم تصور الحمض النووي الريبي باستخدام تلطيخ EtBr. تغيير طبيعة PAGE من الحمض النووي الريبي يشبه الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز للحمض النووي. تهاجر الحمض النووي الريبي أيضًا في الوسط بسبب شحنتها السالبة من القطب السالب إلى القطب الموجب. هناك اختلافان رئيسيان: (1) وسيط الفصل هو بولي أكريلاميد بدلاً من الاغاروز و (2) يتم تغيير طبيعة عينات الحمض النووي الريبي بحيث يتأثر معدل الهجرة في الهلام بالوزن الجزيئي فقط وليس ببنية الحمض النووي الريبي. نظرًا لأن الحمض النووي الريبي يتحول إلى هياكل مستقرة ومعقدة ، يجب تغيير طبيعة فصل الحمض النووي الريبي بواسطة جزيئات الحمض النووي الريبي بالوزن الجزيئي. يتم تحقيق التمسخ باستخدام اليوريا - وهو chaotrop يتنافس مع القواعد النووية للربط H وبالتالي يتكشف جزيء RNA (الشكل 8.1 ب). يشكل بولي أكريلاميد بنية مسامية شبيهة بالشبكة مثل الاغاروز ، لكن حجم المسام أصغر بكثير مما يسمح بفصل الأحماض النووية الأصغر.

هلام بولي أكريلاميد هو بوليمر من مادة الأكريلاميد وميثيلينبيساكريلاميد. ميثيلينبيساكريلاميد مسؤول عن الروابط المتقاطعة بين سلاسل الأكريلاميد التي تنتج بنية مسامية. تحدد نسبة التشابك (النسبة بين مادة الأكريلاميد وميثيلينبيساكرلميد) حجم المسام للوسط. تشير نسبة التشابك الأعلى إلى وسيط بحجم مسام أصغر. تم تصميمه لفصل الحمض النووي الريبي الأصغر (الشكل 8.2).

يؤدي تغيير طبيعة الصفحة إلى إنتاج أنظف حمض نووي ريبوزي. يتم فصل خليط النسخ على صفحة تغيير طبيعة. يتم استئصال (قطع) نطاق RNA المطلوب (مستشعر السموم RNA) من الجل ويتم التصفية من الحمض النووي الريبي. هذه الطريقة تزيل بوليميراز الحمض النووي الريبي ، قالب الحمض النووي ، النيوكليوتيدات غير المستخدمة وأي منها في المختبر توليف RNAs التي تختلف في الحجم عن RNA مستشعر السموم (معظمها RNAs التي كانت نتاج التدهور). يعد تغيير طبيعة تنقية PAGE من الحمض النووي الريبي مضيعة للوقت ويستخدم فقط عندما يكون الحمض النووي الريبي عالي النقاء مطلبًا مطلقًا لتحديد الهيكل ، والتحليل الطيفي الفلوري الذي تم حله بمرور الوقت وما إلى ذلك.

8.5 استخراج الفينول / الكلوروفورم

يزيل استخراج الفينول / الكلوروفورم البوليميراز ومعظم النيوكليوتيدات غير المستخدمة من خليط التفاعل. نظرًا لأن بعض النيوكليوتيدات غير المستخدمة وقالب الحمض النووي لا يزالان في الخليط ، فإن التحديد الدقيق لتركيز الحمض النووي الريبي غير ممكن باستخدام طريقة التنقية هذه (تذكر أن كل هذه الأحماض النووية تمتص ضوء الأشعة فوق البنفسجية عند 260 نانومتر). لتقييم قدرة RNA مستشعر السموم الطافرة على التعرف على التتراسيكلين المضاد الحيوي ، يجب تحديد ألفة الارتباط بين المستشعر المتحور والتتراسيكلين بدقة. نظرًا لأن قياسات تقارب الربط تتطلب معرفة دقيقة بتركيز الحمض النووي الريبي ، فإن استخراج الفينول / الكلوروفورم لا ينتج جودة كافية من الحمض النووي الريبي لأغراضنا.

8.6 تنقية العمود

طريقتنا المفضلة لتنقية الحمض النووي الريبي هي تنقية العمود. هذه الطريقة تشبه إلى حد بعيد تنقية DNA البلازميد أثناء تحضير البلازميد. عندما يتم تصنيع الحمض النووي الريبي في المختبر لأغراض الكيمياء الحيوية ، الهدف هو الحصول على تركيزات عالية من الحمض النووي الريبي المستهدف في الماء. في المقابل ، يتلوث الحمض النووي الريبي بعد التوليف بالبوليميراز ، قالب الحمض النووي ، والنيوكليوتيدات غير المستخدمة والمخزن المؤقت. أثناء تنقية العمود تتم إزالة كل هذه الملوثات. تنقية العمود من الحمض النووي الريبي تستخدم حقيقة أن في المختبر إن الحمض النووي الريبي المركب مشحون بشكل سلبي للغاية (مقارنة بالبروتينات) وصغير نسبيًا (مقارنةً بالحمض النووي النموذجي). تنقية العمود مفيد ؛ نظرًا لأنه سريع ، فإنه يزيل قالب الحمض النووي والنيوكليوتيدات غير المستخدمة ، وبالتالي يتيح التحديد الدقيق لتركيز الحمض النووي الريبي.

تأكد من اتباع البروتوكول تمامًا كما هو مكتوب. احرص دائمًا على ارتداء القفازات وتخزين الحمض النووي الريبي على الجليد لمنع تدهور العينة.

يعتمد البروتوكول الدقيق لتنقية الحمض النووي الريبي على المجموعة المستخدمة وسيتم توفيره في المختبر. ويرد أدناه مخطط عام للإجراء.

  1. عادة ما تبدأ تنقية عمود الرنا بربط خليط النسخ بعمود تبادل الأنيون. تعتمد طريقة الفصل هذه على الفرق في الشحنة بين البروتين والنيوكليوتيدات والأحماض النووية (بوليمرات النيوكليوتيدات).
  2. يرتبط قالب الحمض النووي والحمض النووي الريبي بالعمود ، بينما تتدفق النيوكليوتيدات غير المدمجة (صغيرة جدًا) والبوليميراز (غير المشحونة بدرجة كافية).
  3. قالب الحمض النووي أكبر بكثير (أكثر سالبة الشحنة) من الحمض النووي الريبي الاصطناعي وهذا يعني أنه لا يتم استخلاصه من العمود.

ماذا علينا ان نفعل؟

اليوم سنقوم بتنقية في المختبر RNA جهاز استشعار السموم المركب عبر تنقية العمود ثم تقييم نقاء الحمض النووي الريبي باستخدام تغيير طبيعة اليوريا PAGE وتحديد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية.

البروتوكولات

يتم احتساب احتياجات الكواشف والمعدات لكل ستة فرق طلابية. هناك حوالي 20٪ زائدة متضمنة.

المعدات / الأواني الزجاجية اللازمة

  1. ستة أنابيب اختبار يمكن التخلص منها بحجم 10 مل على الأقل
  2. ثلاث مجموعات من الماصات الدقيقة 20-100 ميكرولتر و 2-20 ميكرولتر
  3. ثلاث مجموعات من الأجهزة المصغرة 3 صفحات protean
  4. مزود الطاقة (لتشغيل صفحة اليوريا)
  5. مطياف الأشعة فوق البنفسجية
  6. نظام التوثيق الجل
  7. عشرون أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل (إيبندورف)
  8. كتلة التسخين (لغلي العينات)

الحلول المطلوبة

  1. 3 لتر 1 x TBE (Tris-borate-EDTA) الرقم الهيدروجيني = 8.0
  2. 30 ميكرولتر 1٪ EtBr
  3. 300 ميكرولتر صبغة تحميل هلام اليوريا (2x) ؛ (6 م يوريا ، 0.5 × تيرابايت ، 1٪ بروموفينول أزرق)
  4. مزيج محلول هلام اليوريا. (6 ميغا يوريا ، 0.5 x TBE ، 10٪ أكريلاميد: نسبة تشابك مكررة من مادة الأكريلاميد 19: 1)
  5. 1 مل 10٪ بيرسلفات الأمونيوم طازج
  6. 50 ميكرولتر TEMED

تنقية العمود من الحمض النووي الريبي

يعتمد البروتوكول على المجموعة المستخدمة وسيتم توفيرها في المختبر. انظر أعلى الصفحة للحصول على نظرة عامة أساسية.

تحديد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية

يتم تحديد تركيز الحمض النووي الريبي بطريقة مماثلة لتركيز الحمض النووي. تمتص الحمض النووي الريبي أيضًا عند 260 نانومتر بسبب القواعد النووية العطرية الحلقية غير المتجانسة. لحساب تركيز الحمض النووي الريبي ، يتم استخدام قانون بير لامبرت: A (@ 260 نانومتر) = ε * c * l حيث l = 1 سم ، c هو تركيز الحمض النووي الريبي في مول / لتر و ε = 1149800 لمستشعر السموم ykkCD RNA.

تغيير طبيعة صفحة من الحمض النووي الريبي

اصنع الجل

  1. قم بتجميع ألواح الهلام وتحقق من عدم وجود تسرب باستخدام EtOH.
  2. يتم وضع ماصة 10 مل من خليط هلام اليوريا في أنبوب اختبار.
  3. إضافة 100 ميكرولتر 10٪ APS و 10 ميكرولتر TEMED لبدء البلمرة.
  4. تخلط جيدا وتسكب بين الأطباق الزجاجية. ضعه في المشط. انتبه ، هذا سريع! انتظر حتى يبلل الجل!
  5. بمجرد بلمرة الجل ، قم بتجميع حشية الجل.
  6. صب 0.5 x TBE عازلة تشغيل في حشية.
  7. اغسل الآبار.
  8. قم بالتشغيل المسبق للجيل لمدة 30 دقيقة عند 15 وات. هذه الخطوة تتخلص من أي أكريلاميد لم يشكل بوليمر وأي جذر حر ينتج أثناء البلمرة.

تحضير العينة وتشغيل الجل. تشغيل 10 ميكرولتر غير المنقى و 10 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المنقى على الجل.

  1. امزج 10 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي مع حجم متساوٍ من صبغة اليوريا (6M يوريا ، 0.5 x TBE ، 1٪ bromophenol blue).
  2. عينات الغليان لمدة 5 دقائق في كتلة التسخين. عينات الدوران السريع.
  3. تحميل العينات على الجل. تذكر المكان الذي حملت فيه عينتك!
  4. قم بتشغيل الجل لمدة 15 دقيقة عند 15 وات أو حتى تصل الصبغة إلى قاع الجل.
  5. ضع الجل في محلول تلطيخ 50 مل (50 مل من المخزن المؤقت للسل و 10 ميكرولتر من EtBr) لمدة 10 دقائق.
  6. هلام المسح.

احتياطات

  1. مادة الأكريلاميد سم عصبي
  2. EtBr هو مادة مسرطنة / مطفر

تأكد من ارتداء القفازات

ملاحظة للمدرس

تم تصميم التجربة في الفصل 8 لتنقية RNA لمستشعر السموم ykkCD ، ولكن يمكن استخدام البروتوكول مع تعديلات طفيفة لأي جزيء RNA آخر. نظرًا للمتطلبات الزمنية لعمل PAGE والتشغيل المسبق لها ، يوصى ببدء جلسة المختبر بصنع الجل ثم تنقية الحمض النووي الريبي أثناء التشغيل المسبق للجيل. تم استخدام مجموعة أدوات إزالة النوكليوتيدات Qiagen ومجموعة GeneJet RNA Cleanup (Thermo Scientific) من قبل المؤلفين ، ولكن يمكن أيضًا استخدام مجموعات مماثلة من بائعين بديلين. يُفضل أن يقوم كل فريق من الطلاب بإنشاء وتشغيل صفحة تغيير طبيعة لزيادة القيمة التعليمية للمختبر ، ولكن إذا كانت الإمدادات محدودة ، فقد تشارك ستة فرق طلابية مادة هلامية. يمكن أيضًا إجراء تغيير طبيعة PAGE بواسطة مساعد التدريس أو المعلم في وقت مبكر. في هذه الحالة ، يكون المختبر أكثر ملاءمة ليتم تسميته عرضًا لتنقية الحمض النووي الريبي.

أسئلة معمل مسبق لتنقية الحمض النووي الريبي

  1. ما هو "التحليل الكهربائي لجيل اليوريا (تغيير طبيعة الصفحة)"؟

  2. ماذا تزيل من عينة RNA أثناء تنقية RNA؟ اذكر شيئين.

  3. ما نوع الاحتياطات التي يجب مراعاتها عند التعامل مع مادة الأكريلاميد؟ اشرح اجابتك.

  4. لتشغيل صفحة تغيير طبيعة ، تحتاج إلى مخزن مؤقت سعة 1 لتر 0.5 × تيرا بايت. حل المخزون هو 10 x TBE. اشرح كيف تقوم بعمل المخزن المؤقت الخاص بك (اعرض حساباتك).

مخطط تقرير المختبر وتوزيع النقاط

1. عدة جمل تحدد الهدف / الغرض من كل إجراء. تأكد من الإشارة بوضوح إلى دور هذه الخطوة في المشروع الصغير (5 نقاط).

2. صف بإيجاز الطرق المتاحة لتنقية الحمض النووي الريبي. وضّح سبب اختيارنا لتنقية العمود في المعمل (7 نقاط).

3. ارسم مخطط انسيابي لتنقية الحمض النووي الريبي. تأكد من الإشارة إلى اسم كل مخزن مؤقت مستخدم وحجم المخزن المؤقت المطلوب (10 نقاط).

4. قم بتضمين صورة لمسح هلام PAGE الذي تم تغيير طبيعته مع وضع علامة على العينات الخاصة بك (4 نقاط).

5. قم بتقييم نقاء مستشعر ykkCD المتحرك RNA عن طريق مقارنة النطاقات قبل وبعد التنقية. اشرح إجابتك (5 نقاط).

6. تقرير تركيز الحمض النووي الريبي ykkCD المنقى الخاص بك. تأكد من استخدام قانون Beer-Lambert ومعامل الانقراض المولي المقدم لتنفيذ الحساب الخاص بك. أظهر عملك (5 نقاط).

7. حساب ykkCD الاستشعار العائد RNA. أظهر عملك (5 نقاط).

8. تقرير نسبة الامتصاصية 260/280 من الحمض النووي الريبي المنقى ykkCD. تقييم نقاء الحمض النووي الريبي على أساس هذه القيمة. ما أنواع الملوثات التي يمكن أن تسبب ذروة طولها حوالي 180 طولًا موجيًا (5 نقاط)؟

9. سؤال تحري الخلل وإصلاحه: أجرى زميلك تنقية الحمض النووي الريبي باستخدام نفس المجموعة التي استخدمتها. أجرى لاحقًا اختبارًا ملزمًا وقرر أن ykkCD RNA (النوع البري) لديه تقارب منخفض للتتراسيكلين. كل من قيم الامتصاصية PAGE و 260/280 الخاصة به تشير إلى الحمض النووي الريبي النظيف ويبدو أنه يتمتع بإنتاجية جيدة. قرر لاحقًا أن محلول الحمض النووي الريبي الخاص به يحتوي على الإيثانول. في حكمك ، أي خطوة من خطوات التطهير ارتكب الخطأ؟ هل هناك أي طريقة لإنقاذ الـ RNA الخاص به (4 نقاط)؟


إشارة متقاطعة إلى التطبيقات ذات الصلة

هذا التطبيق هو 35 U. §371 إدخال الولايات المتحدة للمرحلة الوطنية للطلب الدولي رقم PCT / US2013 / 054635 المقدم في 13 أغسطس 2013 ، والذي يدعي الأولوية لطلب براءات الاختراع المؤقت للولايات المتحدة رقم 61 / 682،957 ، المقدم في 14 أغسطس 2012 بعنوان التوليف والتعديل الكيميائي للعلاج. طلب براءات الاختراع المؤقت لـ Messenger RNA بالولايات المتحدة رقم 61 / 744،806 ، المقدم في 3 أكتوبر 2012 ، بعنوان التوليف والتعديل الكيميائي للرسول العلاجي RNA ، طلب البراءات المؤقت للولايات المتحدة رقم 61/829380 ، المقدم في 31 مايو 2013 ، بعنوان Polymerases وبراءات الاختراع المؤقتة الأمريكية طلب رقم 61/844340 ، تم تقديمه في 9 يوليو 2013 ، بعنوان Fusion Enzymes ، كل منها مدرج هنا كمرجع في مجمله.

1. إنزيم خيمري لتخليق جزيء RNA مغطى ، والإنزيم الكيمري المذكور الذي يشتمل على إنزيم واحد على الأقل من إنزيم بوليميراز الحمض النووي واحد على الأقل ، حيث يشتمل جزيء RNA المغطى المذكور على تعديل كيميائي واحد على الأقل ، وحيث يشتمل إنزيم السد الواحد على الأقل وحدة تحفيز إنزيم تغطية اللقاحات (D1) ووحدة فرعية لتحفيز إنزيم تغطية اللقاحات (D12) ، وحيث يكون بوليميراز الحمض النووي واحدًا على الأقل هو T7 RNA polymerase (T7) في أحد التركيبات التالية: أ) بولي ببتيد واحد يشتمل على D1 مرتبط بـ D12 المرتبط بـ T7 ب) بولي ببتيد واحد يشتمل على D12 مرتبط بـ D1 مرتبط بـ T7 ج) بولي ببتيد واحد يشتمل على T7 مرتبط بـ D1 مرتبط بـ D12 أو د) بولي ببتيد واحد يشتمل على T7 مرتبط بـ D12 المرتبط بـ D1.

2. الإنزيم الكيمري الوارد في المطالبة 1 ، حيث يتم تشفير الوحدة الفرعية D1 بواسطة تسلسل الحمض النووي SEQ ID NO: 178 ويتم تشفير الوحدة الفرعية D12 بواسطة تسلسل الحمض النووي SEQ ID NO: 180.

3. الإنزيم الكيمري وفقاً لعنصر الحماية 1 ، حيث يشتمل إنزيم السد الواحد على الأقل على منطقة أولى من النيوكليوتيدات المرتبطة التي تشفر الوحدة الفرعية D1 التي تحتوي على تسلسل الحمض الأميني رقم التعريف المتسلسل: 179 ومنطقة ثانية من النيوكليوتيدات المرتبطة التي تشفر الوحدة الفرعية D12 التي تحتوي على تسلسل الأحماض الأمينية رقم تعريف التسلسل: 181.

4. الإنزيم الخيمري حسب المطالبة 1 ، حيث يمكن أن يستخدم بوليميراز الحمض النووي واحدًا على الأقل تعديلًا كيميائيًا واحدًا على الأقل في الحمض النووي الريبي أثناء النسخ في المختبر.

5. الإنزيم الكيميري حسب ادعاء 1 ، حيث يتم ترميز بوليميريز T7 RNA بواسطة تسلسل الحمض النووي SEQ ID NO: 176.

6. الإنزيم الكيمري وفقاً لعنصر الحماية 1 ، حيث يشتمل بوليميراز T7 RNA على تسلسل الحمض الأميني SEQ ID NO: 177.

7. الإنزيم الكيمري حسب المطالبة 1 ، حيث يكون بوليميراز الحمض النووي واحدًا على الأقل هو متغير بوليميريز RNA وحيث يكون متغير RNA polymerase هو متغير T7 RNA polymerase.

8. الإنزيم الكيمري حسب عنصر الحماية 7 ، حيث يتم إنتاج متغير بوليميريز T7 RNA باستخدام التطور المستمر.

9. الإنزيم الكيمري حسب المطالبة 8 ، حيث يكون التطور المستمر هو التطور المستمر بمساعدة الملتهمة (PACE).

10. الإنزيم الكيمري حسب المطالبة 7 ، حيث يكون متغير بوليميريز T7 RNA قادرًا على دمج تعديل كيميائي واحد على الأقل في RNA أثناء النسخ في المختبر.

11. الإنزيم الكيمري حسب المطالبة 7 ، حيث يتميز متغير T7 RNA polymerase بزيادة كفاءة النسخ عبر المناطق الغنية بالـ GC مقارنة بنوع T7 RNA polymerase.

12. الإنزيم الكيميري كما هو مذكور في المطالبة 7 ، حيث يتميز متغير T7 RNA polymerase بأنه يحتوي على كفاءة نسخ متزايدة لإنتاج RNA مرسال بالمقارنة مع النوع البري T7 RNA polymerase.

13. الإنزيم الكيمري حسب عنصر الحماية 1 ، حيث يتم ربط D1 و / D12 و / أو T7 باستخدام ببتيد رابط واحد على الأقل.

14- الإنزيم الكيمري حسب المطالبة 13 ، حيث يتم اختيار ببتيد رابط واحد على الأقل من المجموعة التي تتكون من (GGGGS) n و LGGGGSGGGGGSGGGSAAA (رقم تعريف التسلسل: 173) و LSGGGGSGGGGGSGGGGSGGGSAAA (SEQ ID NOK: 174 ID NO: 175) ، حيث يشير n إلى أي عدد صحيح كامل.

15. الإنزيم الكيميري حسب ادعاء 1 ، والذي يشتمل أيضًا على علامة تنقية تقارب ، اختياريًا علامة له.

16. الإنزيم الكيمري حسب ادعاء 1 ، حيث يكون جزيء الرنا المغطى هو مرسال RNA.

17. طريقة لتخليق جزيء RNA مغطى يشتمل على تعديل كيميائي واحد على الأقل ، يشتمل على ملامسة قالب DNA مع الإنزيم الكيمري لعنصر الحماية 1 في ظل ظروف كافية لإنتاج جزيء RNA المغطى.

.18 الطريقة وفقًا لعنصر الحماية 17 ، التي تشتمل على تفاعل من خطوة واحدة لكل من النسخ في المختبر والسد.

19. مجموعة تشتمل على الإنزيم الكيمري وفقًا لعنصر الحماية 1 وتعليمات استخدامه.


الملخص

غالبًا ما ينظم أعضاء عائلة منظم مقاومة المضادات الحيوية المتعددة (MarR) نشاط الجينات من خلال الاستجابة لرابط محدد. في حالة عدم وجود ligand ، تعمل معظم بروتينات MarR كمثبطات ، بينما يؤدي ارتباط ligand إلى ارتباط ضعيف بالحمض النووي وبالتالي زيادة التعبير الجيني. سابقًا ، أظهرنا أن اليورات عبارة عن يجند لـ MftR (منظم نقل ميسر رئيسي) ، والذي يتم ترميزه بواسطة بكتيريا التربة Burkholderia thailandensis. نظهر هنا أن كلاهما mftR والجين المنحى بشكل متباين mftP ترميز بروتين نقل ميسر رئيسي يتم تنظيمه في وجود اليورات. MftR يربط موقعين مشابهين في mftR- mftP منطقة جينية مع تقارب وحساسية مكافئة لليورات. تم الإبلاغ سابقًا عن حدوث طفرات لأربعة بقايا محفوظة في ارتباط اليورات Deinococcus radiodurans HucR و الجذور المشعة قلل PecS بشكل كبير من استقرار البروتين وتقارب ربط الحمض النووي ولكن ليس ارتباط الترابط. تشير هذه البيانات إلى أن البقايا المكافئة لتلك المتورطة في ارتباط الترابط بـ HucR و PecS تخدم أدوارًا هيكلية وأن MftR تعتمد على بقايا متميزة لربط الترابط. يُظهر MftR انتقال ذوبان من خطوتين مما يوحي بالتكشف المستقل لمناطق ربط البوليمر ومناطق ربط الحمض النووي أو الطفرات في مواقع ربط الترابط المتوقعة التي تؤدي إلى تحولات تتكشف من خطوة واحدة. نقترح أن MftR يربط ligand في شق بين فصوص ربط الحمض النووي والواجهة القاتمة ، لكن آلية التوهين بوساطة ligand لربط الحمض النووي تختلف عن تلك المقترحة لمثيلات MarR الأخرى المستجيبة لليورات. نظرًا لأن ارتباط الحمض النووي بواسطة MftR يتم تخفيفه عند 37 درجة مئوية ، فإن بياناتنا تشير أيضًا إلى أن MftR يستجيب لكل من الترابط والارتفاع الحراري عن طريق الربط المخفف للحمض النووي وتنظيم الجينات الخاضعة لسيطرته.


العروض الشفهية

تقاس الكيمياء العضوية للمجرات القريبة بجهاز استقبال جديد واسع النطاق

G. Narayanan 1، R.L Snell 1، N. A. Erickson 1، A. Chung 1، M. Heyer 1، Y. Min 1، W.M Irvine 1،2

1 قسم علم الفلك ، جامعة ماساتشوستس ، أمهيرست ، ماساتشوستس 01003 الولايات المتحدة الأمريكية 2 مركز جودارد لعلم الأحياء الفلكي

تم الحصول على أطياف الطول الموجي المليمتر لعدد من المجرات القريبة في المرصد الفلكي الراديوي الخمس كليات (FCRAO) في ماساتشوستس باستخدام مستقبل واسع النطاق للغاية (إريكسون وآخرون ، 2007).هذه الأداة ، التي نسميها مستقبل البحث عن الانزياح الأحمر (RSR) ، لها عرض نطاق لحظي يبلغ 36 جيجاهرتز وتعمل من 74 إلى 110.5 جيجاهرتز ، مما يسمح بقياس معظم طيف 3 مم مع إعداد جهاز استقبال واحد. تم بناء جهاز الاستقبال في UMass / FCRAO ليكون جزءًا من الأجهزة الأولية للتلسكوب الكبير المليمتر (LMT) ، وهو تلسكوب أحادي الطبق يبلغ قطره 50 مترًا وطوله موجيًا يتم بناؤه بالاشتراك مع UMass ومعهد الفضاء الوطني ، Óptica Electrónica in Mexico (Perez-Grovas et al.، 2006). يقع LMT على ارتفاع 4600 متر عند خط عرض 19 درجة في ولاية بويبلا المكسيكية ، مما يسمح بوصول جيد إلى السماء الجنوبية. إنه مصمم للتشغيل في نطاق الطول الموجي 0.85-4 مم.

جهاز الاستقبال الجديد مصمم لتحديد الانزياح الأحمر وبالتالي مسافة المجرات البعيدة المحجوبة بالغبار ، ولكن يمكن استخدامه أيضًا لفحص كيمياء المجرات. نظرًا لأن LMT لم يكتمل بعد (نأمل في بدء التشغيل الأولي 3 مم هذا العام) ، يتم اختبار جهاز الاستقبال على FCRAO 14 مترًا عن طريق قياس أطياف 3 مم لعدد من المجرات القريبة. توجد اختلافات مثيرة للاهتمام في كيمياء هذه الكائنات ، على سبيل المثال ، في القوة النسبية لخطوط الانبعاث من HCN و HNC و HCO + و CH3OH و 13 CO و CS و N2H + (وكيل لـ N2).

Erickson، N.R، Narayanan، G.، Goeller، R.، & amp Grosslein، R. (2007). من Z-Machines إلى ALMA: مطياف المجرات (Sub) المليمتر ، 375 ، 71

بيريز جروفاس ، إيه إس ، شلورب ، بي إف ، هيوز ، دي ، وأمبير يون ، إم (2006). سبي 6267: 1.

التحقيق في فائض Isovaline Enantiomeric والأحماض الأمينية C5 الأخرى في النيازك الكربونية

جيسون ب. دوركين ، دانيال ب. جلافين

مركز جودارد للبيولوجيا الفلكية ، قسم استكشاف النظام الشمسي ، مركز جودارد لرحلات الفضاء التابع لناسا ، جرينبيلت ، MD 20771 ، الولايات المتحدة الأمريكية

يعد أصل التناسق البيولوجي أحد أكثر الألغاز المحيرة لفهم نشوء الحياة على الأرض. في حين تم اقتراح العديد من النماذج (على سبيل المثال Hazen et al. 2001 Keszthelyi 1984) ، فإن المركبات غير البيولوجية التي تم الإبلاغ عنها والتي تظهر زيادة كبيرة في التماثل هي عدد قليل من الأحماض الأمينية في نيازك CM2 Murchison و Murray (مثل Pizzarello و Cronin 2000 Pizzarello وآخرون ، 2008). من بين هذه الأيزوفالين (α-ethyl-alanine) أهمية خاصة لأنه يتوافر عادة في النيازك CM2 ، وهو نادر للغاية في علم الأحياء ، وبسبب تركيبته الكيميائية من المحتمل أن يحافظ على نسبة D / L البدائية.

بدلاً من تقنية قياس الطيف الكتلي للكتلة اللوني للغاز (GC-MS) التي يستخدمها Pizzarello وآخرون ، استخدمنا كروماتوجرافيا السائل الكشف عن التألق / وقت قياس الطيف الكتلي للرحلة (LC-FD / ToF-MS) لدراسة النسبة التماثلية من الأيزوفالين في النيازك CM2 Murchison و LEW90500 و CR2 QUE99177. لقد ركزنا بشكل خاص على فهم مجموعة الأحماض الأمينية C5 في هذه النيازك. عند القيام بذلك ، قررنا أن حمض D و L 3-aminopentanoic يتشاركان مع L-isovaline و L-valine في ظل ظروف كروماتوجرافية شائعة (Glavin and Dworkin 2006) من أجل ا- فثالديالديهايد / ن أسيتيل إل سيستين (OPA / NAC).

لقد ابتكرنا طريقة لفصل هذه المركبات وسنقوم بالإبلاغ عن نسب D / L الفعلية للأيزوفالين في هذه النيازك وكيفية مقارنتها بقياسات GC-MS لبيتزاريلو وزملاء العمل.

Glavin ، D. P. and Dworkin J. P. (2006) التحقيق في التجاوزات التصورية للأيزوفالين في النيازك CM باستخدام كروماتوجرافيا السائل وقت قياس الطيف الكتلي للطيران. علم الأحياء الفلكي ، 6:105.

(2001) الامتزاز الانتقائي للأحماض الأمينية L و D على الكالسيت: الآثار المترتبة على التماثل الكيميائي الحيوي. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية ، 98: 5487-5490.

Keszthelyi، L. (1984) مراجعة أصل عدم تناسق الجزيئات الحيوية من خلال التفاعل الضعيف: أحدث التطورات. الأصل. تطور الحياة. بيوسف. 11: 9-21.

Pizzarello S. and Cronin J.R (2000) أحماض أمينية غير راسيمية في نيازك موراي ومورشيسون. جيوتشيم. وآخرون Cosmochim. اكتا. 64: 329 - 338.

بيتزاريلو إس هوانج ، واي وألكسندر إم آر (2008) عدم التناسق الجزيئي في الكيمياء خارج الأرض: رؤى من نيزك أصلي .. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية ، 105: 3700-3704.

تسليم المواد الخارجية من المذنبات والكويكبات إلى الأرض البريبايوتيك

مركز كارل ساجان لدراسة الحياة في الكون ، معهد SETI ، 515 N. Whisman Rd. ماونتن فيو CA 94043 USA

ساهمت المذنبات والكويكبات بشكل كبير في جرد المياه والمركبات العضوية على سطح الأرض المبكرة ، وبالتالي قد تلعب دورًا مهمًا في نشأة الحياة. يتطلب التسليم الناجح أن بعض المواد العضوية تتحمل درجات الحرارة الشديدة والضغوط المرتبطة بالتأثير ، وأيضًا أن الماء يصاحب المواد العضوية. كان هناك تقدم كبير في قدرات نمذجة التأثير منذ العمل الأولي لـ Chyba وآخرون (1990) ، والذي لا يزال يستشهد به على نطاق واسع مجتمع Origin of Life. ومع ذلك ، لا تزال نماذج التفاعلات الكيميائية تحت الصدمة محدودة بسبب افتقارنا إلى المعرفة التجريبية والنظرية ذات الصلة في أنظمة الضغط ودرجة الحرارة الديناميكية والمتطرفة. هنا ، سألخص العمل الذي يعالج مسألة إيصال التأثير والتركيز على حالة طور الماء أثناء تصادم مذنب-أرض وكويكب-أرض على مدى مجموعة من زوايا وسرعات الاصطدام. على أساس نتائج النموذج (على سبيل المثال ، Liu et al. ، 2007) التي تم إنشاؤها باستخدام رمز فيزياء الصدمات ثلاثي الأبعاد (GEODYN) ، سأستنتج قابلية بقاء المركبات العضوية والمياه السائلة على مدى مجموعة من سيناريوهات التأثير لمذنب الأرض و اصطدام كويكب بالأرض. سيتم وصف هذه النتائج في سياق تدفق المواد النجمية والماء (كسائل وبخار) إلى الأرض البريبايوتيك.

تشيبا ، سي إف ، بي جيه توماس ، إل بروكشو ، وسي ساغان (1990) إيصال الكواكب للجزيئات العضوية إلى الأرض المبكرة ، العلوم 249: 366-373.

ليو ، بي تي ، آي لوموف ، جي جي بلانك ، وتي إتش أنطون (2007) محاكاة ثلاثية الأبعاد لتأثير المذنب واستمرار بقاء المركبات العضوية ، وقائع 15 عامر. فيز. شركة مؤتمر موضوعي عن ضغط الصدمة للمواد المكثفة ، C304-308.


وصف مختصر للرسومات

سوف تتضح الأشياء السابقة والأشياء والمزايا والمزايا الأخرى من الوصف التالي لنماذج معينة للاختراع ، كما هو موضح في الرسومات المصاحبة حيث تشير الأحرف المرجعية المماثلة إلى نفس الأجزاء من خلال طرق العرض المختلفة. ليس من الضروري أن يتم قياس الرسومات ، بل يتم التركيز بدلاً من ذلك على توضيح مبادئ تجسيدات مختلفة للاختراع.

تين. الشكل 1 تخطيطي للبنية الأولية للاختراع الحالي.

تين. يمثل الشكل 2 نظرة عامة على نظام التطور الموجه المستمر بمساعدة الملوثات (PACE) في بحيرة واحدة كما تم تدريسه بواسطة Esvelt et al (Nature 2011 472 (7344) 499-503).

تين. 3 عبارة عن بلازميد تمثيلي مفيد في تفاعلات IVT التي يتم تدريسها هنا.


تعريفات

في أماكن مختلفة في المواصفات الحالية ، يتم الكشف عن بدائل مركبات الكشف الحالي في مجموعات أو في نطاقات. من المقصود تحديدًا أن يشمل الكشف الحالي كل مجموعة فرعية فردية من أعضاء هذه المجموعات والنطاقات. على سبيل المثال ، المصطلح "C1-6 ألكيل "مخصص بشكل فردي للكشف عن الميثيل ، الإيثيل ، ج3 ألكيل ، ج4 ألكيل ، ج5 ألكيل وج6 ألكيل.

الحيوان: كما هو مستخدم هنا ، يشير المصطلح "حيوان" إلى أي عضو في مملكة الحيوان. في بعض النماذج ، تشير كلمة "حيوان" إلى الإنسان في أي مرحلة من مراحل التطور. في بعض النماذج ، تشير كلمة "حيوان" إلى حيوانات غير بشرية في أي مرحلة من مراحل التطور. في نماذج معينة ، يكون الحيوان غير البشري من الثدييات (على سبيل المثال ، قارض ، فأر ، فأر ، أرنب ، قرد ، كلب ، قطة ، خروف ، ماشية ، قرد ، أو خنزير). في بعض النماذج ، تشمل الحيوانات ، على سبيل المثال لا الحصر ، الثدييات والطيور والزواحف والبرمائيات والأسماك والديدان. في بعض النماذج ، يكون الحيوان حيوانًا معدل وراثيا أو حيوانًا معدلًا وراثيًا أو مستنسخًا.

تقريبًا: كما هو مستخدم هنا ، يشير المصطلح "تقريبًا" أو "حول" ، كما هو مطبق على قيمة واحدة أو أكثر من القيم المهمة ، إلى قيمة مشابهة للقيمة المرجعية المحددة. في نماذج معينة ، يشير المصطلح "تقريبًا" أو "حول" إلى نطاق من القيم التي تقع ضمن 25٪ ، 20٪ ، 19٪ ، 18٪ ، 17٪ ، 16٪ ، 15٪ ، 14٪ ، 13٪ ، 12 ٪ ، 11٪ ، 10٪ ، 9٪ ، 8٪ ، 7٪ ، 6٪ ، 5٪ ، 4٪ ، 3٪ ، 2٪ ، 1٪ ، أو أقل في أي اتجاه (أكبر من أو أقل) من المحدد القيمة المرجعية ما لم يُنص على خلاف ذلك أو واضح من السياق (باستثناء الحالات التي يتجاوز فيها هذا الرقم 100٪ من القيمة المحتملة).

مرتبط بـ: كما هو مستخدم هنا ، فإن المصطلحات "المرتبطة" و "المترافق" و "المرتبط" و "المرفقة" و "المقيدة" ، عند استخدامها فيما يتعلق بقطعتين أو أكثر ، تعني أن الشقوق مرتبطة فعليًا أو متصلة مع بعضها البعض ، إما بشكل مباشر أو عن طريق واحد أو أكثر من الشقوق الإضافية التي تعمل كعامل ربط ، لتشكيل بنية مستقرة بدرجة كافية بحيث تظل الشقوق مرتبطة ماديًا في ظل الظروف التي يتم فيها استخدام الهيكل ، على سبيل المثال ، الظروف الفسيولوجية. لا يلزم أن يكون "الارتباط" صارمًا من خلال الترابط الكيميائي التساهمي المباشر. قد يشير أيضًا إلى ارتباط أيوني أو هيدروجين أو اتصال قائم على التهجين مستقر بدرجة كافية بحيث تظل الكيانات "المرتبطة" مرتبطة ماديًا.

ثنائية الوظيفة: كما هو مستخدم هنا ، يشير المصطلح "ثنائي الوظيفة" إلى أي مادة أو جزيء أو جزء قادر على أو يحافظ على وظيفتين على الأقل. قد تؤثر الوظائف على نفس النتيجة أو نتيجة مختلفة. قد تكون البنية التي تنتج الوظيفة هي نفسها أو مختلفة. على سبيل المثال ، قد تقوم RNAs المعدلة ثنائية الوظيفة للاختراع الحالي بتشفير الببتيد السام للخلايا (الوظيفة الأولى) في حين أن تلك النيوكليوسيدات التي تشتمل على الحمض النووي الريبي المشفر تكون ، في حد ذاتها ، سامة للخلايا (الوظيفة الثانية). في هذا المثال ، لن ينتج عن توصيل الحمض النووي الريبي المعدل ثنائي الوظيفة إلى خلية سرطانية جزيء ببتيد أو بروتين قد يحسن أو يعالج السرطان فحسب ، بل سينقل أيضًا حمولة سامة للخلايا من النيوكليوسيدات إلى الخلية التي يجب أن تتحلل ، بدلاً من ترجمة جزيء البروتين. RNA المعدل تحدث.

نشط بيولوجيًا: كما هو مستخدم هنا ، تشير عبارة "نشطة بيولوجيًا" إلى خاصية أي مادة لها نشاط في نظام بيولوجي و / أو كائن حي. على سبيل المثال ، المادة التي ، عند إعطائها لكائن حي ، لها تأثير بيولوجي على ذلك الكائن الحي ، تعتبر نشطة بيولوجيًا. في تجسيدات معينة ، يمكن اعتبار جزيء الحمض النووي للاختراع الحالي نشطًا بيولوجيًا إذا كان حتى جزء من جزيء الحمض النووي نشطًا بيولوجيًا أو يحاكي نشاطًا يعتبر وثيق الصلة بيولوجيًا.

المصطلحات الكيميائية: كما هو مستخدم هنا ، فإن المصطلح "ألكيل" يُقصد به أن يشير إلى مجموعة هيدروكربون مشبعة تكون ذات سلسلة مستقيمة أو متفرعة. تشتمل مجموعات الألكيل النموذجية على الميثيل (Me) ، والإيثيل (Et) ، والبروبيل (على سبيل المثال ، n-propyl و isopropyl) ، والبوتيل (على سبيل المثال ، n-butyl ، و isobutyl ، و t-butyl) ، و pentyl (على سبيل المثال ، n-pentyl ، isopentyl ، neopentyl) وما شابه ذلك. يمكن أن تحتوي مجموعة الألكيل من 1 إلى حوالي 20 ، من 2 إلى حوالي 20 ، من 1 إلى حوالي 12 ، من 1 إلى حوالي 8 ، من 1 إلى حوالي 6 ، من 1 إلى حوالي 4 ، أو من 1 إلى حوالي 3 ذرات كربون.

كما هو مستخدم هنا ، يشير "ألكينيل" إلى مجموعة ألكيل بها واحد أو أكثر من روابط كربون-كربون مزدوجة. تشتمل أمثلة مجموعات الألكينيل على إيثينيل ، وبروبينيل ، وما شابه ذلك.

كما هو مستخدم هنا ، تشير "ألكوكسي" إلى مجموعة —O- ألكيل. تتضمن أمثلة مجموعات alkoxy methoxy و ethoxy و propoxy (على سبيل المثال ، n-propoxy و isopropoxy) و t-butoxy وما شابه.

كما هو مستخدم هنا ، يشير "alkenyl" إلى ألكيل ، كما هو محدد أعلاه ، يحتوي على رابطة مزدوجة واحدة على الأقل بين ذرات الكربون المجاورة. تشمل الألكينيل كلا من رابطة الدول المستقلة والأيزومرات العابرة. تتضمن السلسلة المستقيمة التمثيلية والألكينيل المتفرعة إيثيلينيل ، بروبيلينيل ، 1-بيوتينيل ، 2-بيوتينيل ، إيزوبيوتيلينيل ، 1-بنتنيل ، 2-بنتنيل ، 3-ميثيل-1-بيوتينيل ، 2-ميثيل-2-بيوتينيل ، 2 ، 3-ثنائي ميثيل -2-بيوتنيل وما شابه ذلك.

كما هو مستخدم هنا ، يشير "ألكينيل" إلى مجموعة ألكيل بها واحد أو أكثر من روابط كربون-كربون ثلاثية. تشتمل مجموعات الألكينيل على سبيل المثال على إيثينيل ، وبروبينيل ، وما شابه ذلك.

كما هو مستخدم هنا ، يشير مصطلح "أريل" إلى أحادي الحلقة أو متعدد الحلقات (على سبيل المثال ، وجود 2 أو 3 أو 4 حلقات مصهورة) هيدروكربونات عطرية مثل ، على سبيل المثال ، فينيل ، نافثيل ، أنثراسينيل ، فينانثرينيل ، إندانيل ، إيندينيل ، وما شابه. في بعض النماذج ، تحتوي مجموعات الأريل من 6 إلى حوالي 20 ذرة كربون.

كما هو مستخدم هنا ، تشتمل "هالو" أو "هالوجين" على الفلورو ، والكلورو ، والبرومو ، واليودو.

المركب: كما هو مستخدم هنا ، فإن المصطلح "مركب" يقصد به أن يشمل جميع الأيزومرات الفراغية ، والأيزومرات الهندسية ، والتوتومرات ، والنظائر للبنى المصورة.

يمكن أن تكون المركبات الموصوفة هنا غير متماثلة (على سبيل المثال ، بها واحد أو أكثر من أجهزة مركزية الفراغ). جميع الأيزومرات الفراغية ، مثل المتماثلات و diastereomers ، مخصصة ما لم يذكر خلاف ذلك. يمكن عزل مركبات الكشف الحالي التي تحتوي على ذرات كربون مستبدلة بشكل غير متماثل في أشكال نشطة بصريًا أو راسيمية. الطرق الخاصة بكيفية تحضير الأشكال النشطة ضوئيًا من مواد البدء النشطة بصريًا معروفة في المجال ، مثل تحليل المخاليط العنصرية أو التوليف الانتقائي الفراغي. يمكن أيضًا أن توجد العديد من الأيزومرات الهندسية للأوليفينات ، روابط C═N المزدوجة ، وما شابه ذلك في المركبات الموصوفة هنا ، وجميع الأيزومرات المستقرة المذكورة في الكشف الحالي. يتم وصف الأيزومرات الهندسية العابرة لرابطة الدول المستقلة والمرتبطة بمركبات الكشف الحالي ويمكن عزلها كمزيج من أيزومرات أو على هيئة أشكال أيزومرية منفصلة.

تشتمل مركبات الكشف الحالي أيضًا على أشكال حشو. تنتج الأشكال Tautomeric من مبادلة رابطة واحدة مع رابطة مزدوجة مجاورة وما يصاحب ذلك من هجرة بروتون. تتضمن الأشكال Tautomeric tautomers الأولية التي هي حالات بروتون متزامنة لها نفس الصيغة التجريبية والشحنة الكلية. من الأمثلة على المواد المشدودة الأولية: أزواج كيتون-إنول ، وأزواج حمض أميد-إيميدك ، وأزواج لاكتام-لاكتيم ، وأزواج حمض أميد-إيميدك ، وأزواج إنامين-إيمين ، وأشكال حلقية حيث يمكن للبروتون أن يشغل موقعين أو أكثر من نظام حلقي غير متجانس ، مثل ، 1H- و 3 H- إيميدازول ، 1H- ، 2H- و 4 H-1،2،4-تريازول ، 1H- و 2 H-isoindole ، و 1 H- و 2 H- بيرازول. يمكن أن تكون الأشكال Tautomeric في حالة توازن أو مغلقة بشكل معقّم في شكل واحد عن طريق الاستبدال المناسب.

تشتمل مركبات الكشف الحالي أيضًا على جميع نظائر الذرات التي تحدث في المركبات الوسيطة أو النهائية. تشير "النظائر" إلى الذرات التي لها نفس العدد الذري ولكن بأعداد كتل مختلفة ناتجة عن عدد مختلف من النيوترونات في النوى. على سبيل المثال ، تشتمل نظائر الهيدروجين على التريتيوم والديوتيريوم.

يمكن تحضير مركبات وأملاح الكشف الحالي في توليفة مع جزيئات المذيبات أو الماء لتكوين مواد مذيبة وهيدرات بالطرق الروتينية.

محفوظ: كما هو مستخدم هنا ، يشير المصطلح "محفوظ" إلى نيوكليوتيدات أو بقايا الأحماض الأمينية لتسلسل عديد النوكليوتيد أو متوالية عديد ببتيد ، على التوالي ، والتي تحدث دون تغيير في نفس الموضع لمتتابعين أو أكثر يتم مقارنتها. النيوكليوتيدات أو الأحماض الأمينية المحفوظة نسبيًا هي تلك التي يتم حفظها بين متواليات أكثر ارتباطًا من النيوكليوتيدات أو الأحماض الأمينية التي تظهر في مكان آخر في التسلسلات.

في بعض النماذج ، يُقال إن متتابعتين أو أكثر "محفوظة تمامًا" إذا كانت متطابقة بنسبة 100٪ مع بعضها البعض. في بعض النماذج ، يُقال إن متتابعين أو أكثر "محفوظون بدرجة عالية" إذا كانت متطابقة بنسبة 70٪ على الأقل ، أو 80٪ على الأقل متطابقة ، أو 90٪ على الأقل متطابقة ، أو 95٪ على الأقل متطابقة مع بعضها البعض. في بعض النماذج ، يُقال إن تسلسلين أو أكثر "محفوظان بدرجة عالية" إذا كانت متطابقة بنسبة 70٪ ، أو حوالي 80٪ متطابقة ، أو حوالي 90٪ متطابقة ، أو حوالي 95٪ ، أو حوالي 98٪ ، أو حوالي 99٪ متطابقة مع بعضها البعض . في بعض التجسيدات ، يُقال إن تسلسلين أو أكثر "محفوظان" إذا كانت 30٪ على الأقل متطابقة ، 40٪ على الأقل متطابقة ، 50٪ على الأقل متطابقة ، 60٪ على الأقل متطابقة ، 70٪ على الأقل متطابقة ، على الأقل 80٪ متطابقة ، 90٪ على الأقل متطابقة ، أو 95٪ على الأقل متطابقة مع بعضها البعض. في بعض التجسيدات ، يُقال إن تسلسلين أو أكثر "محفوظان" إذا كانت متطابقة بنسبة 30٪ تقريبًا ، وحوالي 40٪ متطابقة ، وحوالي 50٪ متطابقة ، وحوالي 60٪ متطابقة ، وحوالي 70٪ متطابقة ، وحوالي 80٪ متطابقة ، وحوالي 90 ٪ متطابقة ، حوالي 95 ٪ متطابقة ، حوالي 98 ٪ متطابقة ، أو حوالي 99 ٪ متطابقة مع بعضها البعض. قد يتم تطبيق حفظ التسلسل على كامل طول قليل النوكليوتيد أو عديد الببتيد أو قد ينطبق على جزء أو منطقة أو ميزة منها.

التسليم: كما هو مستخدم هنا ، يشير "التسليم" إلى فعل أو طريقة تسليم مركب أو مادة أو كيان أو جزء أو شحنة أو حمولة.

عامل التوصيل: كما هو مستخدم هنا ، يشير "عامل التوصيل" إلى أي مادة تسهل ، على الأقل جزئيًا ، التسليم في الجسم الحي لجزيء الحمض النووي إلى الخلايا المستهدفة.

الملصق القابل للكشف: كما هو مستخدم هنا ، يشير "الملصق القابل للاكتشاف" إلى واحد أو أكثر من الواسمات أو الإشارات أو الشقوق المرفقة أو المدمجة أو المرتبطة بكيان آخر يتم اكتشافه بسهولة بالطرق المعروفة في الفن بما في ذلك التصوير الشعاعي ، التألق ، اللمعان الكيميائي ، الأنزيمية النشاط والامتصاصية وما شابه. تشمل الملصقات التي يمكن اكتشافها النظائر المشعة والفلوروفور والكروموفور والإنزيمات والأصباغ والأيونات المعدنية والروابط مثل البيوتين والأفيدين والستريبافيدين والهابتنز والنقاط الكمومية وما شابه. يمكن وضع الملصقات التي يمكن الكشف عنها في أي موضع في الببتيدات أو البروتينات التي تم الكشف عنها هنا. قد تكون داخل الأحماض الأمينية ، الببتيدات ، أو البروتينات ، أو تقع في N- أو C- الطرف.

القاصي: كما هو مستخدم هنا "القاصي" يعني أبعد من كتلة المركز أو خط تناظر الموضوع أو النقطة المرجعية. بالنسبة للأطراف ، فهي أبعد ما تكون عن الجسم.

نظام الجرعات: كما هو مستخدم هنا ، "نظام الجرعات" هو جدول إعطاء أو نظام يحدده الطبيب للعلاج ، أو الوقاية ، أو الرعاية التلطيفية.

عامل تجزئة الجرعة (DSF) - نسبة PUD من علاج تقسيم الجرعة مقسومًا على PUD من إجمالي الجرعة اليومية أو جرعة وحدة واحدة. القيمة مشتقة من مقارنة مجموعات أنظمة الجرعات.

التعبير: كما هو مستخدم هنا ، يشير "التعبير" عن تسلسل الحمض النووي إلى واحد أو أكثر من الأحداث التالية: (1) إنتاج قالب RNA من تسلسل DNA (على سبيل المثال ، عن طريق النسخ) (2) معالجة نسخة RNA (على سبيل المثال ، عن طريق الربط والتحرير وتشكيل 5 غطاء و / أو 3 معالجة نهائية) (3) ترجمة RNA إلى بولي ببتيد أو بروتين و (4) تعديل ما بعد الترجمة لعديد ببتيد أو بروتين.

الصيغة: كما هو مستخدم هنا ، تشتمل "الصيغة" على الأقل على جزيء حمض نووي معدل وعامل توصيل.

وظيفي: كما هو مستخدم هنا ، الجزيء البيولوجي "الوظيفي" هو جزيء بيولوجي في شكل يُظهر فيه خاصية و / أو نشاطًا يتميز به.

Homology: كما هو مستخدم هنا ، يشير مصطلح "homology" إلى الترابط العام بين الجزيئات البوليمرية ، على سبيل المثال. بين جزيئات الحمض النووي (مثل جزيئات DNA و / أو جزيئات RNA) و / أو بين جزيئات polypeptide. في بعض النماذج ، تعتبر الجزيئات البوليمرية "متجانسة" لبعضها البعض إذا كانت متتابعاتها 25٪ على الأقل ، 30٪ على الأقل ، 35٪ على الأقل ، 40٪ على الأقل ، 45٪ على الأقل ، 50٪ على الأقل ، على الأقل 55٪ ، 60٪ على الأقل ، 65٪ على الأقل ، 70٪ على الأقل ، 75٪ على الأقل ، 80٪ على الأقل ، 85٪ على الأقل ، 90٪ على الأقل ، 95٪ على الأقل ، أو 99٪ على الأقل مطابق. في بعض النماذج ، تعتبر الجزيئات البوليمرية "متجانسة" لبعضها البعض إذا كانت متتابعاتها 25٪ على الأقل ، 30٪ على الأقل ، 35٪ على الأقل ، 40٪ على الأقل ، 45٪ على الأقل ، 50٪ على الأقل ، على الأقل 55٪ ، 60٪ على الأقل ، 65٪ على الأقل ، 70٪ على الأقل ، 75٪ على الأقل ، 80٪ على الأقل ، 85٪ على الأقل ، 90٪ على الأقل ، 95٪ على الأقل ، أو 99٪ على الأقل مشابه. يشير المصطلح "متماثل" بالضرورة إلى مقارنة بين متتابعين على الأقل (متواليات عديد النوكليوتيد أو متعدد الببتيد).

وفقًا للاختراع ، يُعتبر متسلسلان من عديد النوكليوتيد متماثلين إذا كانت البولي ببتيدات التي تشفرها متطابقة على الأقل بحوالي 50٪ ، أو على الأقل حوالي 60٪ متطابقة ، أو على الأقل حوالي 70٪ متطابقة ، على الأقل حوالي 80٪ متطابقة ، أو عند حوالي 90٪ على الأقل متطابقة لما لا يقل عن امتداد واحد من حوالي 20 حمض أميني على الأقل.

في بعض النماذج ، تتميز متواليات عديد النوكليوتيد المتجانسة بالقدرة على ترميز امتداد لا يقل عن 4-5 أحماض أمينية محددة بشكل فريد. بالنسبة لتسلسلات عديد النوكليوتيدات التي يقل طولها عن 60 نيوكليوتيد ، يتم تحديد التماثل من خلال القدرة على ترميز امتداد لا يقل عن 4-5 أحماض أمينية محددة بشكل فريد. وفقًا للاختراع ، يُعتبر تسلسلان بروتين متماثلان إذا كانت البروتينات متطابقة على الأقل حوالي 50٪ ، أو حوالي 60٪ متطابقة على الأقل ، أو متطابقة على الأقل حوالي 70٪ ، أو على الأقل حوالي 80٪ متطابقة ، أو على الأقل حوالي 90٪ متطابقة لما لا يقل عن امتداد واحد من حوالي 20 حمض أميني على الأقل.

الهوية: كما هو مستخدم هنا ، يشير المصطلح "هوية" إلى العلاقة الكلية بين الجزيئات البوليمرية ، على سبيل المثال ، بين جزيئات قليل النوكليوتيد (مثل جزيئات DNA و / أو جزيئات RNA) و / أو بين جزيئات بولي ببتيد. يمكن إجراء حساب النسبة المئوية لتسلسلين من عديد النوكليوتيد ، على سبيل المثال ، من خلال محاذاة التسلسلتين لأغراض المقارنة المثلى (على سبيل المثال ، يمكن إدخال الفجوات في واحد أو كليهما من تسلسل الحمض النووي الأول والثاني من أجل المحاذاة المثلى وغير يمكن تجاهل التسلسلات المتطابقة لأغراض المقارنة). في نماذج معينة ، يكون طول التسلسل المحاذي لأغراض المقارنة 30٪ على الأقل ، 40٪ على الأقل ، 50٪ على الأقل ، 60٪ على الأقل ، 70٪ على الأقل ، 80٪ على الأقل ، 90٪ على الأقل ، على الأقل 95٪ على الأقل ، أو 100٪ من طول التسلسل المرجعي. ثم تتم مقارنة النيوكليوتيدات في مواضع النوكليوتيدات المقابلة. عندما يشغل نفس النوكليوتيدات موقعًا في التسلسل الأول مثل الموضع المقابل في التسلسل الثاني ، تكون الجزيئات متطابقة في هذا الموضع. الهوية المئوية بين التسلسلين هي دالة لعدد المواضع المتطابقة التي تتقاسمها التسلسلات ، مع الأخذ في الاعتبار عدد الفجوات وطول كل فجوة ، والتي يجب تقديمها من أجل المحاذاة المثلى للمتسلسلة. يمكن إجراء مقارنة بين التسلسلات وتحديد النسبة المئوية للهوية بين تسلسلين باستخدام خوارزمية رياضية. على سبيل المثال ، يمكن تحديد الهوية المئوية بين تسلسلين للنيوكليوتيدات باستخدام طرق مثل تلك الموضحة في علم الأحياء الجزيئي الحسابي ، ليسك ، إيه إم ، محرر ، مطبعة جامعة أكسفورد ، نيويورك ، 1988 الحوسبة الحيوية: المعلوماتية ومشروعات الجينوم ، سميث ، د. ed.، Academic Press، New York، 1993 Sequence Analysis in Molecular Biology، von Heinje، G.، Academic Press، 1987 Computer Analysis of Sequence Data، Part I، Griffin، AM، and Griffin، HG، eds.، Humana Press، New Jersey، 1994 and Sequence Analysis Primer، Gribskov، M. and Devereux، J.، eds.، M Stockton Press، New York، 1991 تم تضمين كل منها هنا كمرجع. على سبيل المثال ، يمكن تحديد الهوية المئوية بين تسلسلين من النوكليوتيدات باستخدام خوارزمية Meyers and Miller (CABIOS ، 1989 ، 4: 11-17) ، والتي تم دمجها في برنامج ALIGN (الإصدار 2.0) باستخدام جدول بقايا الوزن PAM120 ، عقوبة طول فجوة قدرها 12 وعقوبة فجوة قدرها 4. يمكن ، بدلاً من ذلك ، تحديد الهوية المئوية بين تسلسل نيوكليوتيدات باستخدام برنامج GAP في حزمة برامج GCG باستخدام مصفوفة NWSgapdna.CMP. تتضمن الطرق المستخدمة بشكل شائع لتحديد النسبة المئوية للهوية بين المتتاليات ، على سبيل المثال لا الحصر ، تلك التي تم الكشف عنها في Carillo، H.، and Lipman، D.، SIAM J Applied Math.، 48: 1073 (1988) المدمجة هنا بالمرجع. يتم تقنين تقنيات تحديد الهوية في برامج الكمبيوتر المتاحة للجمهور. تتضمن برامج الكمبيوتر النموذجية لتحديد التماثل بين تسلسلين ، على سبيل المثال لا الحصر ، حزمة برنامج GCG ، Devereux ، J. ، et al. ، بحوث الأحماض النووية ، 12 (1) ، 387 (1984)) ، BLASTP ، BLASTN ، وفاستا أتشول ، S. F. وآخرون ، J. موليك. بيول. ، 215, 403 (1990)).

منع التعبير عن الجين: كما هو مستخدم هنا ، تعني عبارة "منع التعبير عن الجين" التسبب في تقليل كمية منتج تعبير للجين. يمكن أن يكون منتج التعبير عبارة عن RNA منسوخ من الجين (على سبيل المثال ، mRNA) أو بولي ببتيد مترجم من mRNA نسخ من الجين. عادةً ما يؤدي انخفاض مستوى الرنا المرسال إلى انخفاض مستوى عديد الببتيد المترجم منه. يمكن تحديد مستوى التعبير باستخدام التقنيات القياسية لقياس mRNA أو البروتين.

في المختبر: كما هو مستخدم هنا ، يشير المصطلح "في المختبر" إلى الأحداث التي تحدث في بيئة اصطناعية ، على سبيل المثال ، في أنبوب اختبار أو وعاء تفاعل ، في ثقافة الخلية ، في طبق بتري ، وما إلى ذلك ، بدلاً من داخل الكائن الحي (على سبيل المثال ، حيوان أو نبات أو ميكروب).

في الجسم الحي: كما هو مستخدم هنا ، يشير المصطلح "في الجسم الحي" إلى الأحداث التي تحدث داخل كائن حي (على سبيل المثال ، حيوان أو نبات أو ميكروب أو خلية أو نسيج منها).

معزول: كما هو مستخدم هنا ، يشير المصطلح "معزول" إلى مادة أو كيان تم فصله على الأقل عن بعض المكونات التي ارتبطت بها (سواء في الطبيعة أو في بيئة تجريبية). قد تحتوي المواد المعزولة على مستويات متفاوتة من النقاء فيما يتعلق بالمواد التي ارتبطت بها. يمكن فصل المواد و / أو الكيانات المعزولة من حوالي 10٪ على الأقل ، حوالي 20٪ ، حوالي 30٪ ، حوالي 40٪ ، حوالي 50٪ ، حوالي 60٪ ، حوالي 70٪ ، حوالي 80٪ ، حوالي 90٪ ، أو أكثر من المكونات الأخرى التي ارتبطت بها في البداية. في بعض النماذج ، تكون العوامل المعزولة أكثر من حوالي 80٪ ، حوالي 85٪ ، حوالي 90٪ ، حوالي 91٪ ، حوالي 92٪ ، حوالي 93٪ ، حوالي 94٪ ، حوالي 95٪ ، حوالي 96٪ ، حوالي 97٪ ، حوالي 98٪ ، حوالي 99٪ ، أو أكثر من حوالي 99٪ نقاء. كما هو مستخدم هنا ، تكون المادة "نقية" إذا كانت خالية إلى حد كبير من المكونات الأخرى. معزول بشكل كبير: يقصد بعبارة "معزول إلى حد كبير" أن المركب منفصل إلى حد كبير عن البيئة التي تشكل فيها أو تم اكتشافه. يمكن أن يشتمل الفصل الجزئي ، على سبيل المثال ، على تركيبة غنية بمركب الكشف الحالي. يمكن أن يشمل الفصل الجوهري التركيبات التي تحتوي على الأقل على حوالي 50٪ ، على الأقل حوالي 60٪ ، على الأقل حوالي 70٪ ، على الأقل حوالي 80٪ ، على الأقل حوالي 90٪ ، على الأقل حوالي 95٪ ، على الأقل حوالي 97٪ ، أو على الأقل على الأقل حوالي 99٪ بالوزن من مركب الكشف الحالي أو ملح منه. تعتبر طرق عزل المركبات وأملاحها روتينية في الفن.

معدل: كما هو مستخدم هنا يشير مصطلح "معدل" إلى حالة أو بنية متغيرة لجزيء الاختراع. يمكن تعديل الجزيئات بعدة طرق بما في ذلك كيميائيًا وبنيويًا ووظيفيًا. في أحد النماذج ، يتم تعديل جزيئات mRNA للاختراع الحالي عن طريق إدخال نيوكليوسيدات و / أو نيوكليوتيدات غير طبيعية. تم التعديل ، من حيث صلته بالمرنا المعدل ، قد يعني أيضًا أي تغيير يختلف عن النوع البري.

تحدث بشكل طبيعي: كما هو مستخدم هنا ، تعني عبارة "تحدث بشكل طبيعي" الموجودة في الطبيعة بدون مساعدة اصطناعية.

المريض: كما هو مستخدم هنا ، يشير مصطلح "المريض" إلى الشخص الذي قد يسعى أو يحتاج إلى علاج ، أو يحتاج إلى علاج ، أو يتلقى العلاج ، أو سيتلقى العلاج ، أو موضوع يخضع للرعاية من قبل متخصص مدرب لمرض معين أو شرط.

الببتيد: كما هو مستخدم هنا ، "الببتيد" أقل من أو يساوي 50 حمض أميني طويل ، على سبيل المثال ، حوالي 5 ، 10 ، 15 ، 20 ، 25 ، 30 ، 35 ، 40 ، 45 ، أو 50 حمض أميني طويل.

العقاقير الأولية: يشمل الكشف الحالي أيضًا العقاقير الأولية للمركبات الموصوفة هنا. كما هو مستخدم هنا ، تشير "العقاقير الأولية" إلى أي مادة أو جزيء أو كيان يكون في شكل مسند لتلك المادة أو الجزيء أو الكيان للعمل كعلاج عند التغيير الكيميائي أو الفيزيائي. قد يتم ربط العقاقير الأولية بشكل تساهمي أو عزلها بطريقة ما والتي يتم إطلاقها أو تحويلها إلى جزء الدواء الفعال قبل أو عند أو بعد إعطائها لأحد الثدييات. يمكن تحضير العقاقير الأولية عن طريق تعديل المجموعات الوظيفية الموجودة في المركبات بطريقة يتم فيها شق التعديلات ، إما في التلاعب الروتيني أو في الجسم الحي ، على المركبات الأم. تشتمل العقاقير الأولية على مركبات حيث ترتبط مجموعات الهيدروكسيل أو الأمينية أو السلفهيدريل أو الكربوكسيل بأي مجموعة ، عند إعطائها لموضوع من الثدييات ، تنشق لتكوين مجموعة هيدروكسيل أو أمينو أو سلفهيدريل أو كربوكسيل حرة على التوالي. إعداد واستخدام العقاقير الأولية تمت مناقشته في T. Higuchi و V. Stella ، "Pro-Drugs as Novel Delivery Systems ،" المجلد. 14 من A.C.S. سلسلة الندوة ، وفي ناقلات عكسية بيولوجية في تصميم الأدوية، محرر. إدوارد ب. روش ، American Pharmaceutical Association and Pergamon Press ، 1987 ، وكلاهما مدرج بموجب هذا كمرجع في مجملهما.

التكاثر: كما هو مستخدم هنا ، يعني مصطلح "تكاثر" النمو أو التوسع أو الزيادة أو التسبب في النمو أو التوسع أو الزيادة بسرعة. "التكاثري" يعني القدرة على التكاثر. يقصد بمصطلح "مضاد للتكاثر" امتلاك خصائص تتعارض أو لا تتناسب مع الخصائص التكاثرية.

مقبول صيدلانيًا: يتم استخدام عبارة "مقبول صيدلانيًا" هنا للإشارة إلى تلك المركبات و / أو المواد والتركيبات و / أو أشكال الجرعات التي تكون ، في نطاق الحكم الطبي السليم ، مناسبة للاستخدام عند ملامسة أنسجة البشر و الحيوانات التي لا تحتوي على سمية مفرطة ، أو تهيج ، أو حساسية ، أو مشكلة أو مضاعفات أخرى ، بما يتناسب مع نسبة فائدة / مخاطر معقولة.

أملاح مقبولة صيدلانيًا: يتضمن الكشف الحالي أيضًا أملاحًا مقبولة صيدلانيًا للمركبات الموصوفة هنا. كما هو مستخدم هنا ، تشير عبارة "أملاح مقبولة صيدلانيًا" إلى مشتقات المركبات التي تم الكشف عنها حيث يتم تعديل المركب الرئيسي عن طريق تحويل حمض موجود أو جزء قاعدي إلى شكل ملح. تتضمن أمثلة الأملاح المقبولة صيدلانياً ، على سبيل المثال لا الحصر ، الأملاح المعدنية أو الأحماض العضوية للمخلفات الأساسية مثل الأمينات القلوية أو الأملاح العضوية للمخلفات الحمضية مثل الأحماض الكربوكسيلية وما شابه. تشتمل الأملاح المقبولة صيدلانيًا في الكشف الحالي على الأملاح غير السامة التقليدية للمركب الأصلي المتكون ، على سبيل المثال ، من أحماض عضوية أو غير عضوية غير سامة. يمكن تصنيع الأملاح المقبولة صيدلانيًا للكشف الحالي من المركب الرئيسي الذي يحتوي على شق قاعدي أو حمضي بالطرق الكيميائية التقليدية. بشكل عام ، يمكن تحضير هذه الأملاح عن طريق تفاعل الحمض الحر أو الأشكال القاعدية لهذه المركبات مع كمية متكافئة من القاعدة أو الحمض المناسب في الماء أو في مذيب عضوي ، أو في خليط من الاثنين بشكل عام ، وسط غير مائي مثل الأثير ، يفضل أسيتات الإيثيل أو الإيثانول أو الأيزوبروبانول أو الأسيتونتريل. تم العثور على قوائم الأملاح المناسبة في العلوم الصيدلانية في ريمنجتون ، الطبعة 17 ، شركة ماك للنشر ، ايستون ، بنسلفانيا ، 1985 ، ص. 1418 و مجلة العلوم الصيدلانية 66 ، 2 (1977) ، كل منها مدرج هنا كمرجع في مجمله.

بولي ببتيد: كما هو مستخدم هنا ، "بولي ببتيد" يعني بوليمر من بقايا حمض أميني مرتبطة ببعضها البعض بواسطة روابط ببتيدية. يشير المصطلح ، كما هو مستخدم هنا ، إلى البروتينات ، والببتيدات ، والببتيدات من أي حجم ، أو بنية ، أو وظيفة. عادة ، ومع ذلك ، فإن عديد الببتيد سيكون على الأقل 50 حمض أميني طويل. في بعض الحالات ، يكون البولي ببتيد المشفر أصغر من حوالي 50 من الأحماض الأمينية ويطلق على البولي ببتيد اسم الببتيد. إذا كان البولي ببتيد عبارة عن ببتيد ، فسيكون على الأقل حوالي 5 بقايا من الأحماض الأمينية طويلة. وبالتالي ، تشتمل عديد الببتيدات على منتجات الجينات ، وعديد ببتيدات تحدث بشكل طبيعي ، وعديد ببتيدات اصطناعية ، ومتجانسات ، وتقويم ، و Paralogs ، وشظايا ومكافئات أخرى ، ومتغيرات ، ونظائر ما سبق. قد يكون عديد الببتيد جزيءًا منفردًا أو قد يكون معقدًا متعدد الجزيئات مثل ثنائى أو قاطع أو رباعي. قد ينطبق المصطلح عديد الببتيد أيضًا على بوليمرات الأحماض الأمينية التي يكون فيها واحد أو أكثر من بقايا الأحماض الأمينية عبارة عن نظير كيميائي اصطناعي للحمض الأميني المقابل الذي يحدث بشكل طبيعي.

عديد ببتيد لكل وحدة دواء (PUD): كما هو مستخدم هنا ، يتم تعريف PUD أو منتج لكل وحدة دواء ، على أنه جزء مقسم من إجمالي الجرعة اليومية ، عادةً 1 مجم ، pg ، كجم ، إلخ ، من منتج (مثل بولي ببتيد ) كما تم قياسه في سوائل الجسم أو الأنسجة ، وعادة ما يتم تحديده في التركيز مثل pmol / mL ، mmol / mL ، إلخ مقسومًا على القياس في سائل الجسم.

قريب: كما هو مستخدم هنا ، تعني كلمة "قريب" أقرب إلى كتلة المركز أو خط تناظر الموضوع أو النقطة المرجعية. بالنسبة للأطراف ، فهو أقرب إلى الجسم.

العينة: كما هو مستخدم هنا ، يشير مصطلح "عينة" إلى مجموعة فرعية من الأنسجة أو الخلايا أو الأجزاء المكونة لها (على سبيل المثال ، سوائل الجسم ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الدم المحيطي ، المصل ، البلازما ، الاستسقاء ، البول ، السائل النخاعي (CSF) ، البلغم ، اللعاب ، نخاع العظام ، السائل الزليلي ، الخلط المائي ، السائل الأمنيوسي ، الصملاخ ، حليب الثدي ، سائل غسل القصبات ، السائل المنوي ، سائل البروستات ، سائل الراعي أو سائل ما قبل القذف ، العرق ، البراز ، الشعر ، الدموع ، سائل الكيس ، السائل الجنبي والصفاقي ، السائل التامور ، اللمف ، الكيموس ، الكايل ، الصفراء ، السائل الخلالي ، الحيض ، القيح ، الزهم ، القيء ، الإفرازات المهبلية ، إفراز الغشاء المخاطي ، ماء البراز ، عصير البنكرياس ، سوائل غسل تجاويف الجيوب الأنفية ، تجويف القصبات الرئوية ، السائل ودم الحبل السري). قد تشتمل العينة أيضًا على متجانسة أو محللة أو مستخلص محضر من كائن حي كامل أو مجموعة فرعية من أنسجته أو خلاياه أو أجزائه المكونة ، أو جزء منه أو جزء منه ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر ، البلازما أو المصل أو السائل الشوكي ، السائل الليمفاوي ، الأقسام الخارجية للجلد ، الجهاز التنفسي ، الأمعاء ، الجهاز البولي التناسلي ، الدموع ، اللعاب ، الحليب ، خلايا الدم ، الأورام ، الأعضاء. تشير العينة أيضًا إلى وسيط ، مثل مرق المغذيات أو الجل ، والذي قد يحتوي على مكونات خلوية ، مثل البروتينات أو جزيء الحمض النووي.

التشابه: كما هو مستخدم هنا ، يشير مصطلح "تشابه" إلى الترابط العام بين الجزيئات البوليمرية ، على سبيل المثال بين جزيئات عديد النوكليوتيد (مثل جزيئات DNA و / أو جزيئات RNA) و / أو بين جزيئات polypeptide. يمكن حساب النسبة المئوية للتشابه بين الجزيئات البوليمرية مع بعضها البعض بنفس طريقة حساب مطابقة النسبة المئوية ، باستثناء أن حساب النسبة المئوية للتشابه يأخذ في الاعتبار البدائل المحافظة كما هو مفهوم في الفن.

مستقر: كما هو مستخدم هنا ، يشير مصطلح "مستقر" إلى مركب قوي بدرجة كافية ليحمل العزل إلى درجة مفيدة من النقاوة من خليط التفاعل ، ويفضل أن يكون قادرًا على الصياغة إلى عامل علاجي فعال.

الموضوع: كما هو مستخدم في هذه الوثيقة ، يشير المصطلح "موضوع" أو "مريض" إلى أي كائن يمكن أن يتم إعطاء تركيبة له وفقًا للاختراع ، على سبيل المثال ، للأغراض التجريبية والتشخيصية والوقائية و / أو العلاجية. تشمل الموضوعات النموذجية الحيوانات (مثل الثدييات مثل الفئران والجرذان والأرانب والرئيسيات غير البشرية والبشر) و / أو النباتات.

جوهريًا: كما هو مستخدم هنا ، يشير المصطلح "جوهريًا" إلى الحالة النوعية لإظهار المدى الكلي أو شبه الكلي أو درجة الخاصية أو الخاصية محل الاهتمام. ستفهم إحدى المهارات العادية في الفنون البيولوجية أن الظواهر البيولوجية والكيميائية نادرًا ما تصل إلى مرحلة الاكتمال و / أو تنتقل إلى الاكتمال أو تحقق أو تتجنب نتيجة مطلقة ، إن وجدت. لذلك يتم استخدام المصطلح "جوهري" هنا لالتقاط النقص المحتمل في الاكتمال المتأصل في العديد من الظواهر البيولوجية والكيميائية.

متساوي إلى حد كبير: كما هو مستخدم هنا من حيث علاقته بالاختلافات الزمنية بين الجرعات ، فإن المصطلح يعني زائد / ناقص 2٪.

بشكل كبير في وقت واحد: كما هو مستخدم هنا وفيما يتعلق بتعدد الجرعات ، فإن المصطلح يعني خلال ثانيتين.

في نفس الوقت: كما هو مستخدم هنا ، تعني كلمة "في نفس الوقت" ضمن التكاثر العلمي ، في نفس الوقت.

المعاناة من: شخص "يعاني" من مرض و / أو اضطراب و / أو حالة تم تشخيصه أو ظهوره بواحد أو أكثر من أعراض مرض أو اضطراب و / أو حالة.

عرضة لـ: فرد "عرضة" لمرض و / أو اضطراب و / أو حالة لم يتم تشخيصه و / أو قد لا تظهر عليه أعراض المرض و / أو الاضطراب و / أو الحالة ولكنه يميل إلى الإصابة بمرض أو أعراضه. في بعض التجسيدات ، قد يتسم الفرد المعرض للإصابة بمرض و / أو اضطراب و / أو حالة (على سبيل المثال ، السرطان) بواحد أو أكثر مما يلي: (1) طفرة جينية مرتبطة بتطور المرض والاضطراب و / أو حالة (2) تعدد الأشكال الجيني المرتبط بتطور المرض و / أو الاضطراب و / أو الحالة (3) زيادة و / أو نقصان التعبير و / أو نشاط البروتين و / أو الحمض النووي المرتبط بالمرض ، اضطراب و / أو حالة (4) عادات و / أو أنماط حياة مرتبطة بتطور المرض و / أو الاضطراب و / أو الحالة (5) تاريخ عائلي للمرض والاضطراب و / أو الحالة و (6) التعرض و / أو / أو الإصابة بميكروب مرتبط بتطور المرض و / أو الاضطراب و / أو الحالة. في بعض النماذج ، فإن الفرد الذي يكون عرضة للإصابة بمرض و / أو اضطراب و / أو حالة سوف يصاب بمرض و / أو اضطراب و / أو حالة. في بعض النماذج ، لن يصاب الفرد المعرض لمرض ، و / أو اضطراب ، و / أو حالة المرض ، و / أو الاضطراب ، و / أو الحالة.

اصطناعي: يقصد بمصطلح "تركيبي" إنتاجه و / أو تحضيره و / أو صنعه بيد الإنسان.قد يكون تخليق عديد النوكليوتيدات أو عديد الببتيدات أو جزيئات أخرى من الاختراع الحالي كيميائيًا أو إنزيميًا.

جرعة الوحدة المفردة: كما هو مستخدم هنا ، "جرعة الوحدة المفردة" هي جرعة من أي علاج يتم إعطاؤه في جرعة واحدة / في وقت واحد / مسار واحد / نقطة اتصال واحدة ، أي حدث إدارة مفردة.

الجرعة اليومية الإجمالية: كما هو مستخدم هنا ، "الجرعة اليومية الإجمالية" هي كمية معطاة أو موصوفة في فترة 24 ساعة. يمكن إعطاؤه كجرعة وحدة واحدة.

الجرعة المقسمة: كما هو مستخدم هنا ، "الجرعة المقسمة" هي تقسيم جرعة الوحدة المفردة أو الجرعة اليومية الكلية إلى جرعتين أو أكثر.

الخلايا المستهدفة: كما هو مستخدم هنا ، تشير "الخلايا المستهدفة" إلى أي خلية واحدة أو أكثر من الخلايا ذات الأهمية. يمكن العثور على الخلايا في المختبر أو في الجسم الحي أو في الموقع أو في نسيج أو عضو كائن حي. قد يكون الكائن الحي حيوانًا ، ويفضل أن يكون حيوانًا ثدييًا ، ويفضل أن يكون إنسانًا ويفضل أن يكون مريضًا.

العامل العلاجي: يشير مصطلح "العامل العلاجي" إلى أي عامل ، عند إعطائه لشخص ما ، يكون له تأثير علاجي ، و / أو تشخيصي ، و / أو وقائي و / أو يثير التأثير البيولوجي و / أو الدوائي المرغوب.

الكمية المؤثرة علاجياً: كما هو مستخدم هنا ، مصطلح "كمية فعالة علاجياً" يعني كمية من العامل المراد تسليمه (على سبيل المثال ، حمض نووي ، دواء ، عامل علاجي ، عامل تشخيص ، عامل وقائي ، إلخ) يكون كافياً عند إعطائه إلى شخص يعاني أو عرضة للإصابة بمرض و / أو اضطراب و / أو حالة ، لعلاج وتحسين أعراض و / أو تشخيص و / أو منع و / أو تأخير ظهور المرض و / أو الاضطراب و / أو الحالة.

عامل النسخ: كما هو مستخدم هنا ، يشير مصطلح "عامل النسخ" إلى بروتين مرتبط بالحمض النووي ينظم نسخ DNA إلى RNA ، على سبيل المثال ، عن طريق تنشيط أو قمع النسخ. تؤثر بعض عوامل النسخ على تنظيم النسخ بمفرده ، بينما يعمل البعض الآخر بالتنسيق مع البروتينات الأخرى. يمكن لبعض عوامل النسخ تنشيط النسخ وقمعه في ظل ظروف معينة. بشكل عام ، تربط عوامل النسخ تسلسلًا مستهدفًا محددًا أو تسلسلات تشبه إلى حد كبير تسلسل إجماع محدد في منطقة تنظيمية للجين المستهدف. قد تنظم عوامل النسخ نسخ الجين المستهدف بمفرده أو في معقد مع جزيئات أخرى.

المعالجة: كما هو مستخدم هنا ، يشير مصطلح "معالجة" إلى التخفيف ، جزئيًا أو كليًا ، أو تحسين ، أو تحسين ، أو تخفيف ، أو تأخير ظهور ، أو تثبيط تقدم ، أو تقليل شدة ، و / أو تقليل حدوث واحد أو أكثر من الأعراض أو السمات من مرض و / أو اضطراب و / أو حالة معينة. على سبيل المثال ، قد يشير مصطلح "علاج" السرطان إلى تثبيط بقاء الورم و / أو نموه و / أو انتشاره. يمكن إعطاء العلاج لموضوع لا تظهر عليه علامات مرض أو اضطراب و / أو حالة و / أو إلى شخص لا يظهر إلا علامات مبكرة لمرض و / أو اضطراب و / أو حالة بغرض تقليل المخاطر لتطوير علم الأمراض المرتبط بالمرض والاضطراب و / أو الحالة.

غير معدل: كما هو مستخدم هنا ، يشير مصطلح "غير معدل" إلى أي مادة أو مركب أو جزيء قبل أن يتم تغييره بأي شكل من الأشكال. قد تشير غير المعدلة ، ولكن ليس دائمًا ، إلى النوع البري أو الشكل الأصلي للجزيء الحيوي. قد تخضع الجزيئات لسلسلة من التعديلات حيث يمكن لكل جزيء معدل أن يعمل كجزيء بدء "غير معدل" لتعديل لاحق.


وصف تفصيلي للاختراع

يوفر الاختراع الحالي أجسامًا مضادة أو شظايا مرتبطة بمولد الضد والتي ترتبط على وجه التحديد بحلقات مطابقة في المجال خارج الخلية لـ PSMA ، والتركيبات التي تحتوي على واحد أو مجموعة من هذه الأجسام المضادة أو شظايا مرتبطة بمولد الضد منها ، وخطوط خلايا الورم الهجين التي تنتج الأجسام المضادة ، والطرق من استخدام الأجسام المضادة أو شظايا مرتبطة بمولد الضد لتشخيص وعلاج السرطان.

مستضد غشاء البروستات النوعي (PSMA) عبارة عن بروتين سكري غشائي من النوع الثاني يبلغ 100 كيلو دالتون معبر عنه في أنسجة البروستاتا وتم تحديده في الأصل من خلال التفاعل مع جسم مضاد أحادي النسيلة محدد بـ 7E11-C5 (Horoszewicz et al. ، 1987 ، الدقة المضادة للسرطان. 7: 927-935 براءة الاختراع الأمريكية. رقم 5،162،504). تم الحصول على PSMA في صورة نقية (Wright et al. ، 1990 ، المناعية المناعية للجسم المضاد والمستحضرات الصيدلانية المشعة 3: الملخص 193) وتم وصفها على أنها بروتين عبر الغشاء من النوع الثاني له هوية تسلسلية مع مستقبل الترانسفيرين (إسرائيلي وآخرون ، 1994 ، الدقة السرطان. 54: 1807-1811) ومع نشاط NAALADase (كارتر وآخرون ، 1996 ، بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية. 93: 749-753). والأهم من ذلك ، أنه يتم التعبير عن PSMA بكميات متزايدة في سرطان البروستاتا ، كما يمكن اكتشاف المستويات المرتفعة من PSMA في مصل هؤلاء المرضى (Horoszewicz et al.، 1987 Rochon et al.، 1994، البروستات 25: 219-223 مورفي وآخرون ، 1995 ، البروستات 26: 164-168 ومورفي وآخرون ، 1995 ، الدقة المضادة للسرطان. 15: 1473-1479). يزيد تعبير PSMA مع تقدم المرض ، ويصبح أعلى في المرض النقيلي الهرموني الذي لا يوجد علاج له حاليًا. تشير البيانات الحديثة الاستفزازية إلى أن PSMA يتم التعبير عنه أيضًا بكثرة في الأوعية الدموية لمجموعة متنوعة من الأورام المهمة الأخرى ، بما في ذلك خلايا أورام المثانة والبنكرياس والساركوما والورم الميلانيني والرئة والكلى ، ولكن ليس في الأوعية الدموية الطبيعية.

يوفر أحد جوانب الاختراع جسمًا مضادًا معزولًا أو جزء منه يرتبط بمولد الضد والذي يرتبط على وجه التحديد بمجال خارج الخلية من PSMA حيث يثبط الجسم المضاد أو الجزء المرتبط بمولد الضد بشكل تنافسي الارتباط المحدد لجسم مضاد ثانٍ مع حلقته المستهدفة على PSMA ، وحيث يتم اختيار الجسم المضاد الثاني من المجموعة التي تتكون من PSMA 3.7 و PSMA 3.8 و PSMA 3.9 و PSMA 3.11 و PSMA 5.4 و PSMA 7.1 و PSMA 7.3 و PSMA 10.3 و PSMA 1.8.3 و PSMA A3.1.3 و PSMA A3. 3.1 ، 4.248.2 ، 4.360.3 ، 4.7.1 ، 4.4.1 ، 4.177.3 ، 4.16.1 ، 4.22.3 ، 4.28.3 ، 4.40.2 ، 4.48.3 ، 4.49.1 ، 4.209.3 ، 4.219.3 و 4.288.1 و 4.333.1 و 4.54.1 و 4.153.1 و 4.232.3 و 4.292.3 و 4.304.1 و 4.78.1 و 4.152.1.

يوفر جانب آخر من الاختراع جسمًا مضادًا معزولًا أو جزء منه يرتبط بمولد الضد والذي يرتبط على وجه التحديد بحلقة على PSMA محدد بواسطة جسم مضاد تم اختياره من مجموعة تتكون من PSMA 3.7 و PSMA 3.8 و PSMA 3.9 و PSMA 3.11 و PSMA 5.4 و PSMA 7.1 ، PSMA 7.3 ، PSMA 10.3 ، PSMA 1.8.3 ، PSMA A3.1.3 ، PSMA A3.3.1 ، 4.248.2 ، 4.360.3 ، 4.7.1 ، 4.4.1 ، 4.177.3 ، 4.16.1 ، 4.22.3 ، 4.28.3 ، 4.40.2 ، 4.48.3 ، 4.49.1 ، 4.209.3 ، 4.219.3 ، 4.288.1 ، 4.333.1 ، 4.54.1 ، 4.153.1 ، 4.232.3 ، 4.292.3 ، 4.304 .1 و 4.78.1 و 4.152.1.

على وجه الخصوص ، يتم إنتاج هذه الأجسام المضادة بواسطة الأورام الهجينة المشار إليها هنا باسم PSMA 3.7 و PSMA 3.8 و PSMA 3.9 و PSMA 3.11 و PSMA 5.4 و PSMA 7.1 و PSMA 7.3 و PSMA 10.3 و PSMA 1.8.3 و PSMA A3.1.3 و PSMA A3 .3.1، Abgenix 4.248.2، Abgenix 4.360.3، Abgenix 4.7.1، Abgenix 4.4.1، Abgenix 4.177.3، Abgenix 4.16.1، Abgenix 4.22.3، Abgenix 4.28.3، Abgenix 4.40.2، Abgenix 4.48 .3 ، Abgenix 4.49.1 ، Abgenix 4.209.3 ، Abgenix 4.219.3 ، Abgenix 4.288.1 ، Abgenix 4.333.1 ، Abgenix 4.54.1 ، Abgenix 4.153.1 ، Abgenix 4.232.3 ، Abgenix 4.292.3 ، Abgenix 4.304 .1 و Abgenix 4.78.1 و Abgenix 4.152.1 على التوالي. تم إيداع هذه الأورام الهجينة لدى ATCC كسلطة إيداع دولية ومنحت التعيينات التالية لإيداع البراءات (الجدول 1):

في سمة أخرى للاختراع ، يتم توفير الأجسام المضادة التي لها تسلسلات معينة. على وجه التحديد ، يتم اختيار الأجسام المضادة من المجموعة التي تتكون من أجسام مضادة تشتمل على: سلسلة ثقيلة مشفرة بواسطة جزيء حمض نووي يشتمل على منطقة تشفير سلسلة ثقيلة أو مناطق من تسلسل نيوكليوتيد منتقى من المجموعة المكونة من متواليات نيوكليوتيد موضحة كرقم تعريف SEQ: الشكل 2-7 ، وسلسلة خفيفة مشفرة بواسطة جزيء حمض نووي تشتمل على منطقة أو مناطق تشفير السلسلة الخفيفة المختارة من المجموعة المكونة من متواليات نيوكليوتيدات محددة كرقم تعريف التسلسل: 8-13. يتم أيضًا توفير شظايا مرتبطة بمولد الضد من الأجسام المضادة السابقة.

ترميز البلازميدات السلاسل الثقيلة والخفيفة للأجسام المضادة PSMA 10.3 ، AB-PG1-XG1-006 ، AB-PG1-XG1-026 ، AB-PG1-XG1-051 ، AB-PG1-XG1-069 ، AB-PG1-XG1 -077 تم إيداعها أيضًا لدى ATCC وهي موضحة في الجدول 1 أعلاه. كما هو مستخدم هنا ، يمكن استخدام أسماء الأورام الهجينة أو البلازميدات المترسبة بالتبادل مع أسماء الأجسام المضادة. سيكون من الواضح للشخص المهاري في الفن عندما يقصد بالاسم الإشارة إلى الجسم المضاد أو عندما يشير إلى البلازميدات أو الأورام الهجينة التي تقوم بتشفير أو إنتاج الأجسام المضادة ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون أسماء الأجسام المضادة عبارة عن شكل مختصر للاسم الموضح في الجدول 1. على سبيل المثال ، يمكن الإشارة إلى الجسم المضاد AB-PG1-XG1-006 باسم AB-PG1-XG1-006 ، PG1-XG1-006 ، XG1-006 ، 006 ، إلخ. في مثال آخر ، قد يُشار إلى اسم الجسم المضاد PSMA 4.232.3 باسم PSMA 4.232.1 ، 4.232.3 ، 4.232.1 ، 4.232 ، إلخ. يشير الجسم المضاد إلى نفس الجسم المضاد وليس إلى آخر.

يتم أيضًا توفير الأجسام المضادة التي يتم تشفيرها بواسطة مجموعات معينة من متواليات السلاسل الثقيلة والخفيفة. في أحد النماذج ، يتم ترميز جسم مضاد (AB-PG1-XG1-006) بواسطة جزيء حمض نووي والذي يشتمل على منطقة أو مناطق تشفير لتسلسلات الحمض النووي الموضحة على النحو التالي: رقم تعريف التسلسل: 2 و 8. في تجسيد آخر ، يتم تشفير الجسم المضاد (AB-PG1-XG1-026) بواسطة جزيئات الحمض النووي التي تشتمل على منطقة الترميز أو مناطق متواليات النيوكليوتيدات الموضحة على النحو التالي: رقم تعريف التسلسل: 3 و 9. في تجسيد آخر لا يزال الجسم المضاد (AB) -PG1-XG1-051) بواسطة جزيئات الحمض النووي التي تشتمل على منطقة الترميز أو مناطق متواليات النيوكليوتيدات الموضحة على النحو التالي: رقم تعريف التسلسل: 4 و 10. في تجسيد آخر أيضًا ، يكون الجسم المضاد (AB-PG1-XG1-069) يتم ترميزه بواسطة جزيئات الحمض النووي التي تشتمل على منطقة الترميز أو مناطق متواليات النيوكليوتيدات الموضحة على النحو التالي: رقم تعريف التسلسل: 5 و 11. في نموذج آخر ، يتم ترميز الجسم المضاد (AB-PG1-XG1-077) بواسطة جزيئات الحمض النووي التي تشتمل على منطقة أو مناطق تشفير متواليات النوكليوتيدات الموضحة على النحو التالي: رقم تعريف التسلسل: 6 و 12. في نموذج آخر ، يتم ترميز الجسم المضاد (PSMA 10.3) بواسطة جزيئات الحمض النووي التي تشتمل على منطقة الترميز أو مناطق متواليات النوكليوتيدات الموضحة على النحو التالي: أرقام معرف التسلسل: 7 و 13.

في التجسيدات المفضلة بشكل خاص ، تشتمل الأجسام المضادة على منطقة متغيرة ثقيلة السلسلة مشفرة بواسطة جزيء حمض نووي يشتمل على مناطق أو مناطق تشفير من تسلسل نيوكليوتيد منتقى من المجموعة التي تتكون من متواليات نيوكليوتيد موضحة على النحو التالي: SEQ ID NOs: 14 ، 18 ، 22 ، 26 و 30 ، ومنطقة متغيرة السلسلة الخفيفة مشفرة بواسطة جزيء حمض نووي يشتمل على منطقة أو منطقة تشفير متوالية نيوكليوتيد منتقاة من المجموعة التي تتكون من متواليات نيوكليوتيد موضحة على النحو التالي: رقم تعريف التسلسل: 16 ، 20 ، 24 ، 28 و 32. كما هو مستخدم هنا ، تشير "منطقة التشفير" إلى منطقة من تسلسل النيوكليوتيد الذي يشفر تسلسل متعدد الببتيد يمكن أن تشتمل منطقة التشفير على منطقة ترميز لجزء من البروتين الذي يتم قطعه لاحقًا ، مثل إشارة الببتيد. .

سيقدر أصحاب المهارة في المجال أن الاختراع يتضمن أحماض نووية وعديد ببتيدات تشتمل على متواليات نيوكليوتيد وأحماض أمينية مقدمة هنا. في بعض الحالات ، قد تتضمن متواليات النيوكليوتيدات والأحماض الأمينية متواليات تشفر أو تكون ببتيدات إشارة. يشمل الاختراع كل من هذه المتتاليات مع أو بدون جزء من التسلسل الذي يشفر أو يكون ببتيد إشارة.

يتم أيضًا توفير الأجسام المضادة التي تتضمن مجموعات معينة من المتواليات المتغيرة الثقيلة والخفيفة السلسلة. في أحد التجسيدات ، يشتمل الجسم المضاد (AB-PG1-XG1-006) على تسلسل متغير للجلوبيولين المناعي مشفر بواسطة جزيئات الحمض النووي الذي يتضمن منطقة أو مناطق تشفير متواليات الحمض النووي الموضحة على النحو التالي: رقم تعريف التسلسل: 14 و 16. وبالمثل ، يمكن أن يشتمل الجسم المضاد على تسلسل متغير للجلوبيولين المناعي والذي يشتمل على متواليات الأحماض الأمينية الموضحة كرقمات تعريف SEQ: 15 و 17. في نموذج آخر ، يشتمل الجسم المضاد (AB-PG1-XG1-026) على تسلسل متغير للجلوبيولين المناعي مشفر بواسطة جزيئات الحمض النووي تشتمل على منطقة أو مناطق تشفير متواليات النوكليوتيدات الموضحة على النحو التالي: رقم تعريف التسلسل: 18 و 20 أو يتضمن تسلسل متغير للجلوبيولين المناعي الذي يشتمل على متواليات الأحماض الأمينية الموضحة كرقمات تعريف التسلسل: 19 و 21. AB-PG1-XG1-051) يتضمن تسلسلًا متغيرًا للجلوبيولين المناعي مشفرًا بواسطة جزيئات الحمض النووي التي تشتمل على منطقة الترميز أو مناطق متواليات النوكليوتيدات الموضحة على النحو التالي: SEQ ID NOs: 22 و 24 أو يتضمن تسلسل متغير للجلوبيولين المناعي والذي يشتمل على الحمض الأميني التسلسلات الموضحة كرقمات تعريف التسلسل: 23 و 25. في نموذج آخر ، يشتمل الجسم المضاد (AB-PG1-XG1-069) على تسلسل متغير من الجلوبيولين المناعي مشفر بواسطة الحمض النووي mo lecules تشتمل على منطقة أو مناطق تشفير متواليات النوكليوتيدات الموضحة على النحو التالي: رقم تعريف التسلسل: 26 و 28 أو يتضمن تسلسل متغير للجلوبيولين المناعي الذي يشتمل على متواليات الأحماض الأمينية المحددة كرقم تعريف التسلسل: 27 و 29. في نموذج آخر ، يكون الجسم المضاد ( AB-PG1-XG1-077) يتضمن تسلسلًا متغيرًا للجلوبيولين المناعي مشفرًا بواسطة جزيئات الحمض النووي التي تشتمل على منطقة الترميز أو مناطق متواليات النيوكليوتيدات الموضحة على النحو التالي: SEQ ID NOs: 30 و 32 أو يتضمن تسلسل متغير للجلوبيولين المناعي الذي يشتمل على الحمض الأميني التسلسلات المنصوص عليها كرقمي معرف التسلسل: 31 و 33.

في نماذج معينة ، يتم ترميز الجسم المضاد بواسطة جزيء حمض نووي شديد التماثل مع جزيئات الحمض النووي السابقة. على نحو مفضل ، يشتمل جزيء الحمض النووي المتماثل على تسلسل نيوكليوتيد يكون على الأقل حوالي 90٪ متطابق مع تسلسل النيوكليوتيدات المقدم هنا. بشكل مفضل أكثر ، يكون متوالية النوكليوتيدات متطابقة على الأقل حوالي 95٪ ، على الأقل حوالي 97٪ متطابقة ، على الأقل حوالي 98٪ متطابقة ، أو على الأقل حوالي 99٪ متطابقة مع تسلسل النوكليوتيدات المقدم هنا. يمكن حساب التماثل باستخدام أدوات برمجية متنوعة ومتاحة للجمهور معروفة جيدًا لأحد ذوي المهارات العادية في المجال. تشمل الأدوات النموذجية نظام بلاست المتاح من الموقع الإلكتروني للمركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) في المعاهد الوطنية للصحة.

إحدى طرق تحديد متواليات النوكليوتيدات شديدة التماثل هي عن طريق تهجين الحمض النووي. وبالتالي ، يشتمل الاختراع أيضًا على أجسام مضادة لها خصائص ارتباط PSMA وخصائص وظيفية أخرى موصوفة هنا ، والتي تم تشفيرها بواسطة جزيئات الحمض النووي التي يتم تهجينها تحت ظروف صرامة عالية مع جزيئات الحمض النووي السابقة. يمكن أيضًا تحديد التسلسلات ذات الصلة باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) وتقنيات التضخيم الأخرى المناسبة لاستنساخ متواليات الحمض النووي ذات الصلة. على نحو مفضل ، يتم اختيار بادئات PCR لتضخيم أجزاء من تسلسل الحمض النووي ذي الأهمية ، مثل CDR.

يشير المصطلح "شروط صرامة عالية" كما هو مستخدم هنا إلى المعلمات التي يكون الفن مألوفًا بها. يمكن العثور على معلمات تهجين الحمض النووي في المراجع التي تجمع مثل هذه الطرق ، على سبيل المثال الاستنساخ الجزيئي: دليل معمل، J. Sambrook، et al.، eds.، Second Edition، Cold Spring Harbor Laboratory Press، Cold Spring Harbour، N. Y. 1989، or البروتوكولات الحالية في علم الأحياء الجزيئي، F.M Ausubel ، et al. ، eds. ، John Wiley &. الأبناء ، نيويورك. أحد الأمثلة على ظروف الصرامة العالية هو التهجين عند 65 درجة مئوية في المخزن المؤقت للتهجين (3.5X SSC ، 0.02٪ FICOLL ، 0.02٪ بولي فينيل بيروليدون ، 0.02٪ مصل الأبقار الألبومين ، 2.5 ملي مولار الصوديوم2ص4(الرقم الهيدروجيني 7) ، 0.5٪ SDS ، 2 مم EDTA). SSC هو 0.15 M كلوريد الصوديوم / 0.015 M سترات الصوديوم ، و pH7 ​​SDS عبارة عن كبريتات دوديسيل الصوديوم و EDTA عبارة عن حمض إيثيلين ديامينيتراسيتيك. بعد التهجين ، يتم غسل الغشاء الذي يتم نقل الحمض النووي عليه ، على سبيل المثال ، في 2X SSC عند درجة حرارة الغرفة ثم عند 0.1-0.5X SSC / 0.1X SDS عند درجات حرارة تصل إلى 68 درجة مئوية.

في نماذج مفضلة أخرى ، تشتمل الأجسام المضادة على منطقة متغيرة ثقيلة السلسلة تشتمل على تسلسل حمض أميني مختار من المجموعة التي تتكون من متواليات حمض أميني موضحة على النحو التالي: SEQ ID NOs: 15 ، 19 ، 23 ، 27 و 31 ، ومتغير سلسلة خفيفة منطقة تشتمل على تسلسل حمض أميني مختار من المجموعة التي تتكون من متواليات نيوكليوتيد موضحة على النحو التالي: رقم تعريف التسلسل: 17 ، 21 ، 25 ، 29 و 33. يتم أيضًا توفير أجزاء ربط مولد الضد لما سبق ، كما هو موصوف في مكان آخر هنا.

كما هو مستخدم هنا ، يشير المصطلح "جسم مضاد" إلى بروتين سكري يشتمل على سلسلتين ثقيلتين (H) على الأقل وسلسلتين خفيفتين (L) متصلتين ببعضهما بواسطة روابط ثاني كبريتيد. تتكون كل سلسلة ثقيلة من منطقة متغيرة ثقيلة السلسلة (يتم اختصارها هنا كـ HCVR أو Vح) ومنطقة ثابتة ذات سلسلة ثقيلة. تتكون المنطقة الثابتة للسلسلة الثقيلة من ثلاثة مجالات ، Cح1 ، جح2 و جح3. تتكون كل سلسلة خفيفة من منطقة متغيرة السلسلة الخفيفة (يتم اختصارها هنا بـ LCVR أو Vإل) ومنطقة ثابتة ذات سلسلة خفيفة. تتكون المنطقة الثابتة للسلسلة الخفيفة من مجال واحد ، CL. الخامسح و V.إل يمكن تقسيم المناطق إلى مناطق ذات قابلية عالية للتغير ، تسمى مناطق تحديد التكامل (CDR) ، تتخللها مناطق أكثر حفظًا ، تسمى مناطق إطار العمل (FR). كل V.ح و V.إل يتكون من ثلاثة CDRs وأربعة FRs ، مرتبة من طرف أميني إلى طرف كربوكسي بالترتيب التالي: FR1 ، CDR1 ، FR2 ، CDR2 ، FR3 ، CDR3 ، FR4. تحتوي المناطق المتغيرة من السلاسل الثقيلة والخفيفة على مجال ربط يتفاعل مع مستضد. قد تتوسط المناطق الثابتة للأجسام المضادة في ارتباط الغلوبولين المناعي بالأنسجة أو العوامل المضيفة ، بما في ذلك الخلايا المختلفة للجهاز المناعي (على سبيل المثال ، الخلايا المستجيبة) والمكون الأول (C1q) للنظام المكمل الكلاسيكي.

يشير المصطلح "جزء ربط مولد الضد" لجسم مضاد كما هو مستخدم هنا ، إلى جزء واحد أو أكثر من الجسم المضاد الذي يحتفظ بالقدرة على الارتباط بمولد ضد (على سبيل المثال ، PSMA). لقد تم إثبات أن وظيفة ربط مولد الضد لجسم مضاد يمكن أن تؤديها أجزاء من جسم مضاد كامل الطول. تتضمن أمثلة أجزاء الربط المضمنة في مصطلح "جزء ربط مولد الضد" لجسم مضاد (1) جزء Fab ، وهو جزء أحادي التكافؤ يتكون من Vإل، الخامسح، جإل و جح1 المجالات (ii) a F (ab ′)2 جزء ، جزء ثنائي التكافؤ يتكون من جزأين فاب مرتبطين بجسر ثاني كبريتيد في منطقة المفصلة (3) جزء Fd يتكون من Vح و CH1 (4) جزء Fv يتكون من V.إل و V.ح مجالات ذراع واحد من الجسم المضاد ، (v) جزء dAb (Ward وآخرون ، (1989) طبيعة سجية 341: 544-546) والذي يتكون من حرف V.ح المجال و (6) منطقة تحديد التكامل المعزول (CDR). علاوة على ذلك ، على الرغم من أن المجالين لجزء Fv ، V و V.ح، يتم ترميزها بواسطة جينات منفصلة ، ويمكن ربطها ، باستخدام طرق إعادة الارتباط ، بواسطة رابط اصطناعي يمكّنها من صنعها كسلسلة بروتين واحدة حيث يكون Vإل و V.ح تقترن المناطق لتشكيل جزيئات أحادية التكافؤ (تُعرف باسم سلسلة واحدة Fv (scFv) انظر على سبيل المثال ، Bird et al. (1988) علم 242: 423-426 و Huston et al. (1988) بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 85: 5879-5883). يتم أيضًا تضمين هذه الأجسام المضادة أحادية السلسلة في المصطلح "جزء ربط مولد الضد" من الجسم المضاد. يتم الحصول على أجزاء الجسم المضاد هذه باستخدام الإجراءات التقليدية ، مثل إجراءات التجزئة المحللة للبروتين ، كما هو موضح في J. تقنيات أخرى معروفة لذوي المهارة في الفن. يتم فحص الأجزاء من أجل المنفعة بنفس الطريقة التي يتم بها فحص الأجسام المضادة السليمة.

يقصد بـ "الجسم المضاد المعزول" ، كما هو مستخدم هنا ، للإشارة إلى الجسم المضاد الذي يكون خاليًا إلى حد كبير من الأجسام المضادة الأخرى التي لها خصائص مستضدية مختلفة (على سبيل المثال ، يكون الجسم المضاد المعزول الذي يرتبط على وجه التحديد بـ PSMA خاليًا إلى حد كبير من الأجسام المضادة التي تربط المستضدات على وجه التحديد بخلاف PSMA). قد يكون للجسم المضاد المعزول الذي يرتبط على وجه التحديد بحاتمة أو شكل إسوي أو متغير من PSMA تفاعل متصالب مع مستضدات أخرى ذات صلة ، على سبيل المثال ، من الأنواع الأخرى (على سبيل المثال ، متماثلات أنواع PSMA). علاوة على ذلك ، قد يكون الجسم المضاد المعزول خاليًا إلى حد كبير من المواد الخلوية الأخرى و / أو المواد الكيميائية. كما هو مستخدم هنا ، يشير "الارتباط المحدد" إلى ارتباط الجسم المضاد بمولد ضد محدد مسبقًا. بشكل نموذجي ، يرتبط الجسم المضاد بتقارب أكبر بمقدار ضعفين على الأقل من تقاربه للارتباط بمولد ضد غير محدد (على سبيل المثال ، BSA ، الكازين) بخلاف المستضد المحدد مسبقًا أو مولد ضد وثيق الصلة.

تشتمل الأجسام المضادة المعزولة وفقًا للاختراع على العديد من الأنماط المتشابهة للأجسام المضادة ، مثل IgG1 و IgG2 و IgG3 و IgG4 و IgM و IgA1 و IgA2 و IgAsec و IgD و IgE. كما هو مستخدم هنا ، يشير "النمط المتماثل" إلى فئة الجسم المضاد (على سبيل المثال IgM أو IgG1) المشفر بواسطة جينات المنطقة الثابتة الثقيلة السلسلة. يمكن أن تكون الأجسام المضادة كاملة الطول أو يمكن أن تشتمل فقط على جزء ربط بمولد الضد مثل ثابت الجسم المضاد و / أو المجال المتغير لـ IgG1 أو IgG2 أو IgG3 أو IgG4 أو IgM أو IgA1 أو IgA2 أو IgAsec أو IgD أو IgE أو يمكن أن تتكون من جزء فاب ، أ F (أب ′)2 جزء ، وجزء Fv.

يمكن أن تكون الأجسام المضادة الخاصة بالاختراع الحالي متعددة النسيلة أو أحادية النسيلة أو خليط من الأجسام المضادة متعددة النسيلة وحيدة النسيلة. يمكن إنتاج الأجسام المضادة من خلال مجموعة متنوعة من التقنيات المعروفة جيدًا في المجال. إن إجراءات رفع الأجسام المضادة متعددة النسيلة معروفة جيدًا. على سبيل المثال ، يتم رفع الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة لـ PSMA عن طريق إعطاء بروتين PSMA تحت الجلد إلى الأرانب البيضاء النيوزيلندية التي تم نزفها أولاً للحصول على مصل ما قبل المناعة. يمكن حقن PSMA بحجم إجمالي 100 ميكرولتر لكل موقع في ستة مواقع مختلفة ، عادةً مع تعديل واحد أو أكثر. يتم بعد ذلك نزف الأرانب بعد أسبوعين من الحقن الأول ويتم تعزيزها بشكل دوري بنفس المستضد ثلاث مرات كل ستة أسابيع. يتم جمع عينة من المصل بعد 10 أيام من كل دفعة. يتم استخلاص الأجسام المضادة متعددة النسيلة من المصل ، ويفضل عن طريق كروماتوجرافيا التقارب باستخدام PSMA لالتقاط الجسم المضاد. تم الكشف عن هذا الإجراء وغيره من الإجراءات لرفع الأجسام المضادة متعددة النسيلة في E. Harlow، et. al.، editors، Antibodies: A Laboratory Manual (1988) ، والذي تم تضمينه بموجب هذا كمرجع.

قد يتأثر إنتاج الأجسام المضادة أحادية النسيلة بتقنيات معروفة جيدًا أيضًا في المجال. يشير المصطلح "جسم مضاد أحادي النسيلة" ، كما هو مستخدم هنا ، إلى تحضير جزيئات الجسم المضاد ذات التركيب الجزيئي الفردي. يُظهر الجسم المضاد أحادي النسيلة خصوصية ارتباط واحدة وألفة لقمة معينة. تتضمن عملية إنتاج الأجسام المضادة أحادية النسيلة الحصول على خلايا جسدية مناعية مع إمكانية إنتاج الجسم المضاد ، ولا سيما الخلايا الليمفاوية البائية ، التي تم تحصينها مسبقًا بمولد الضد محل الاهتمام سواء في الجسم الحي أو في المختبر وتكون مناسبة للاندماج مع خلية ب خط المايلوما.

يتم تحصين الخلايا الليمفاوية للثدييات بشكل نموذجي عن طريق التحصين في الجسم الحي للحيوان (على سبيل المثال ، فأر) بالبروتين المطلوب أو متعدد الببتيد ، على سبيل المثال ، مع PSMA في الاختراع الحالي. تتكرر مثل هذه التحصينات حسب الضرورة على فترات تصل إلى عدة أسابيع للحصول على عيار كافٍ من الأجسام المضادة. بمجرد تحصين الحيوانات ، يمكن استخدامها كمصدر للخلايا الليمفاوية المنتجة للأجسام المضادة. بعد التعزيز الأخير للمستضد ، يتم التضحية بالحيوانات وإزالة خلايا الطحال. تعطي الخلايا الليمفاوية للفأر نسبة أعلى من الاندماجات المستقرة مع خطوط المايلوما الفأرية الموصوفة هنا. من بين هؤلاء ، يفضل استخدام الماوس BALB / c. ومع ذلك ، يمكن أيضًا استخدام سلالات الفئران الأخرى والأرانب والهامستر والأغنام والضفادع كمضيفين لإعداد الخلايا المنتجة للأجسام المضادة. انظر Goding (in Monoclonal Antibodies: Principles and Practice، 2d ed.، pp. 60-61، Orlando، Fla.، Academic Press، 1986). على وجه الخصوص ، يُفضل استخدام سلالات الفئران التي تحتوي على جينات الغلوبولين المناعي البشري المُدخلة في الجينوم (والتي لا يمكنها إنتاج الغلوبولين المناعي للفأر). تشمل الأمثلة سلالات HUMAB-MOUSE التي تنتجها Medarex / GenPharm International ، وسلالات XENOMOUSE التي تنتجها Abgenix. تنتج مثل هذه الفئران جزيئات الغلوبولين المناعي البشري بالكامل استجابةً للتحصين.

تلك الخلايا المنتجة للأجسام المضادة الموجودة في مرحلة الانقسام البلازمي تندمج بشكل تفضيلي. يمكن الحصول على الخلايا الجسدية من العقد الليمفاوية والطحال والدم المحيطي للحيوانات التي تستعد للمستضد ، وتعتمد الخلايا الليمفاوية المختارة إلى حد كبير على فائدتها التجريبية في نظام الاندماج المعين. يتم بعد ذلك دمج الخلايا الليمفاوية التي تفرز الجسم المضاد مع خلايا الورم النخاعي للخلايا B (الماوس) أو الخلايا المحولة ، والتي تكون قادرة على التكاثر إلى أجل غير مسمى في ثقافة الخلية ، وبالتالي إنتاج خط خلوي خالٍ من إفراز الغلوبولين المناعي. يتم استزراع الخلايا المندمجة الناتجة ، أو الورم الهجين ، ويتم فحص المستعمرات الناتجة لإنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المرغوبة. يتم استنساخ المستعمرات التي تنتج مثل هذه الأجسام المضادة ، وتنمو إما في الجسم الحي أو في المختبر لإنتاج كميات كبيرة من الأجسام المضادة. تم توضيح وصف الأساس النظري والمنهجية العملية لدمج هذه الخلايا في كولر وميلشتاين ، طبيعة سجية 256: 495 (1975) ، والتي تم تضمينها بموجب هذا بالإشارة.

بدلاً من ذلك ، تكون الخلايا الجسدية البشرية القادرة على إنتاج الأجسام المضادة ، وخاصة الخلايا الليمفاوية B ، مناسبة للاندماج مع خطوط خلايا الورم النقوي. بينما يمكن استخدام الخلايا الليمفاوية B من الطحال أو اللوزتين أو العقد الليمفاوية للفرد ، فإن الخلايا الليمفاوية B في الدم المحيطي التي يسهل الوصول إليها هي الأفضل. قد يتم اشتقاق الخلايا الليمفاوية من مرضى سرطان البروستات المشخص أو سرطان آخر يعبر عن PSMA. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتم تخليد الخلايا البائية البشرية بشكل مباشر بواسطة فيروس إبشتاين بار (كول وآخرون ، 1995 ، الأجسام المضادة أحادية النسيلة وعلاج السرطان ، Alan R. Liss ، Inc. ، ص 77-96). على الرغم من تفضيل إجراءات تهجين الخلايا الجسدية ، من حيث المبدأ ، يمكن استخدام تقنيات أخرى لإنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة مثل التحول الفيروسي أو الورمي للخلايا اللمفاوية البائية.

يُفضل أن تكون خطوط خلايا المايلوما المناسبة للاستخدام في إجراءات الاندماج المنتجة للورم الهجين غير منتجة للأجسام المضادة ، ولها كفاءة اندماج عالية ، ونقص في الإنزيم يجعلها غير قادرة على النمو في بعض الوسائط الانتقائية التي تدعم نمو الأورام الهجينة المرغوبة. تتضمن أمثلة خطوط خلايا المايلوما التي يمكن استخدامها لإنتاج خطوط الخلايا المنصهرة P3-X63 / Ag8 و X63-Ag8.653 و NS1 / 1.Ag 4.1 و Sp2 / 0-Ag14 و FO و NSO / U و MPC -11 و MPC11-X45-GTG 1.7 و S194 / 5XX0 Bul ، كلها مشتقة من الفئران R210.RCY3 و Y3-Ag 1.2.3 و IR983F و 4B210 المشتقة من الفئران و U-266 و GM1500-GRG2 و LICR-LON-HMy2 ، UC729-6 ، كلها مشتقة من البشر (Goding ، في الأجسام المضادة وحيدة النسيلة: المبادئ والممارسات ، الطبعة الثانية ، ص 65-66 ، أورلاندو ، فلوريدا ، الصحافة الأكاديمية ، 1986 كامبل ، في تقنية الأجسام المضادة أحادية النسيلة ، تقنيات المختبر في الكيمياء الحيوية and Molecular Biology Vol. 13، Burden and Von Knippenberg، eds. pp. 75-83، Amsterdam، Elseview، 1984).

يتأثر الاندماج مع خلايا المايلوما في الثدييات أو شركاء الاندماج الآخرين القادرون على التكاثر إلى أجل غير مسمى في زراعة الخلايا بتقنيات قياسية ومعروفة ، على سبيل المثال ، باستخدام البولي إيثيلين جلايكول ("PEG") أو عوامل الانصهار الأخرى (انظر Milstein and Kohler ، يورو. J. إمونول. 6: 511 (1976) ، والتي أدرجت بموجب هذا بالإحالة).

في نماذج أخرى ، يمكن أن تكون الأجسام المضادة أجسامًا مضادة مأشوبة. يُقصد بمصطلح "الجسم المضاد المؤتلف" ، كما هو مستخدم هنا ، أن يشمل الأجسام المضادة التي يتم تحضيرها أو التعبير عنها أو تكوينها أو عزلها بوسائل مؤتلفة ، مثل الأجسام المضادة المعزولة من حيوان (على سبيل المثال ، فأر) والتي تكون معدلة وراثيًا لأنواع أخرى من الغلوبولين المناعي الجينات ، والأجسام المضادة التي يتم التعبير عنها باستخدام ناقل التعبير المؤتلف المنقول إلى خلية مضيفة ، أو الأجسام المضادة المعزولة من مكتبة الأجسام المضادة المؤتلفة أو الاندماجية ، أو الأجسام المضادة التي تم تحضيرها أو التعبير عنها أو تكوينها أو عزلها بأي وسيلة أخرى تتضمن ربط متواليات جينات الغلوبولين المناعي إلى متواليات أخرى من الحمض النووي.

في تجسيدات أخرى حتى الآن ، يمكن أن تكون الأجسام المضادة خيمرية أو أجسام مضادة متوافقة مع البشر. كما هو مستخدم هنا ، يشير المصطلح "الجسم المضاد الخيمري" إلى الجسم المضاد ، الذي يدمج المناطق المتغيرة الفأرية أو المناطق شديدة التغير مع المنطقة البشرية الثابتة أو مناطق الإطار الثابتة والمتغيرة. كما هو مستخدم هنا ، يشير المصطلح "الجسم المضاد المتوافق مع البشر" إلى الجسم المضاد الذي يحتفظ فقط بـ CDRs المرتبطة بمولد الضد من الجسم المضاد الأصلي بالاشتراك مع مناطق الإطار البشرية (انظر Waldmann ، 1991 ، علم 252: 1657). من المتوقع أن تكون هذه الأجسام المضادة الخيمرية أو المتوافقة مع البشر التي تحتفظ بخصوصية الارتباط بالجسم المضاد للفأر قد قللت من المناعة عند إعطائها في الجسم الحي للتطبيقات التشخيصية أو الوقائية أو العلاجية وفقًا للاختراع.

وفقًا لنموذج بديل ، يمكن تعديل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة للاختراع الحالي لتكون في شكل جسم مضاد ثنائي الخصوصية ، أو جسم مضاد متعدد الأنواع. يُقصد بمصطلح "جسم مضاد ثنائي الخصوصية" أن يشمل أي عامل ، على سبيل المثال ، بروتين أو ببتيد أو بروتين أو معقد ببتيد ، له نوعان مختلفان من خصائص الارتباط التي ترتبط أو تتفاعل مع (أ) مستضد سطح الخلية و (ب) مستقبل Fc على سطح الخلية المستجيبة. يُقصد بمصطلح "جسم مضاد متعدد الخصوصية" أن يشمل أي عامل ، على سبيل المثال ، بروتين أو ببتيد أو بروتين أو معقد ببتيد ، والذي يحتوي على أكثر من نوعين مختلفين من خصائص الارتباط التي ترتبط أو تتفاعل مع (أ) مستضد سطح الخلية ، ( ب) مستقبل Fe على سطح خلية مستجيب ، و (ج) مكون واحد آخر على الأقل. وفقًا لذلك ، يشتمل الاختراع ، على سبيل المثال لا الحصر ، على أجسام مضادة ثنائية الخصوصية وثلاثية الخصوصية ورباعية النوعية وغيرها من الأجسام المضادة متعددة النوعية والتي يتم توجيهها إلى مستضدات سطح الخلية ، مثل PSMA ، ومستقبلات الحديد على الخلايا المستجيبة. يشمل مصطلح "الأجسام المضادة ثنائية الخصوصية" أيضًا الأجسام المضادة ثنائية الخصوصية. أجسام السكري هي أجسام مضادة ثنائية التكافؤ ، حيث يكون V.ح و V.إل يتم التعبير عن المجالات على سلسلة بولي ببتيد واحدة ، ولكن باستخدام رابط قصير جدًا للسماح بالاقتران بين المجالين في نفس السلسلة ، وبالتالي إجبار المجالات على الاقتران مع المجالات التكميلية لسلسلة أخرى وإنشاء موقعين لربط مولد الضد ( انظر على سبيل المثال Holliger، P.، et al. (1993) بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 90: 6444-6448 Poijak، R.J، et al. (1994) بنية 2:1121-1123).

يمكن تكوين الجسم المضاد ثنائي الخصوصية من منطقة ارتباط بمولد الضد خاصة بالمجال خارج الخلية لـ PSMA ومنطقة ربط مولد الضد الخاصة بالخلية المستجيبة التي لها نشاط مبيد للأورام أو مثبط للورم. ترتبط منطقتا الارتباط بمولد الضد في الجسم المضاد ثنائي الخصوصية إما كيميائيًا أو يمكن التعبير عنها بواسطة خلية معدلة وراثيًا لإنتاج الجسم المضاد ثنائي الخصوصية. (انظر بشكل عام ، فانجر وآخرون ، 1995 أخبار المخدرات &بيرسبك. 8 (3): 133-137). تشمل الخلايا الفعالة المناسبة التي لها نشاط مبيد للأورام ، على سبيل المثال لا الحصر ، الخلايا التائية السامة للخلايا (خلايا CD8 + بشكل أساسي) ، والخلايا القاتلة الطبيعية ، وما إلى ذلك. يتم إعطاء كمية فعالة من الجسم المضاد ثنائي الخصوصية وفقًا للاختراع لمريض سرطان سجود وثنائي النوع يقتل الجسم المضاد و / أو يمنع تكاثر الخلايا الخبيثة بعد التوطين في مواقع الأورام الأولية أو النقيلية التي تحمل PSMA.

في تجسيدات معينة ، تكون الأجسام المضادة أجسامًا مضادة بشرية. المصطلح "جسم مضاد بشري" ، كما هو مستخدم هنا ، يهدف إلى تضمين أجسام مضادة لها مناطق متغيرة وثابتة مشتقة من متواليات الجلوبيولين المناعي للخط الجرثومي البشري. قد تشتمل الأجسام المضادة البشرية الواردة في الاختراع على بقايا حمض أميني غير مشفرة بواسطة متواليات الجلوبيولين المناعي للخط الجرثومي البشري (على سبيل المثال ، الطفرات التي تم إدخالها بواسطة الطفرات العشوائية أو الخاصة بالموقع في المختبر أو عن طريق الطفرة الجسدية في الجسم الحي). ومع ذلك ، فإن المصطلح "جسم مضاد بشري" ، كما هو مستخدم في هذه الوثيقة ، لا يُقصد به أن يشمل الأجسام المضادة التي يتم فيها تطعيم متواليات CDR المشتقة من السلالة الجرثومية لأنواع أخرى من الثدييات ، مثل الفأر ، على متواليات هيكلية بشرية (يشار إليها هنا باسم "متوافقة مع البشر" الأجسام المضادة "). يتم إنشاء الأجسام المضادة البشرية الموجهة ضد PSMA باستخدام الفئران المعدلة وراثيًا التي تحمل أجزاء من جهاز المناعة البشري بدلاً من نظام الماوس.

يمكن أيضًا تحضير الأجسام المضادة وحيدة النسيلة البشرية بالكامل عن طريق تحصين الفئران المعدلة وراثيًا لأجزاء كبيرة من الغلوبولين المناعي البشري الثقيل ومواضع السلسلة الخفيفة. انظر ، على سبيل المثال ، براءة الاختراع الأمريكية. الأرقام 5،591،669 ، 5،598،369 ، 5،545،806 ، 5،545،807 ، 6،150،584 ، والمراجع المذكورة فيها ، ومحتوياتها مدرجة هنا كمرجع. تم تعديل هذه الحيوانات وراثيًا بحيث يكون هناك حذف وظيفي في إنتاج الأجسام المضادة الذاتية (مثل الفئران). يتم تعديل الحيوانات أيضًا لاحتواء كل أو جزء من موضع جين الغلوبولين المناعي البشري الخطي الجرثومي بحيث ينتج عن تحصين هذه الحيوانات إنتاج أجسام مضادة بشرية كاملة لمولد الضد المعني. بعد تحصين هذه الفئران (على سبيل المثال ، XENOMOUSE (Abgenix) ، فئران HUMAB (Medarex / GenPharm)) ، يتم تحضير الأجسام المضادة وحيدة النسيلة وفقًا لتقنية الورم الهجين القياسي. تحتوي هذه الأجسام المضادة وحيدة النسيلة على متواليات من الأحماض الأمينية المناعية البشرية ، وبالتالي لن تثير استجابات الجسم المضاد للفأر البشري (HAMA) عند إعطائها للبشر.

يفضل أن يكون عمر الفئران من 6 إلى 16 أسبوعًا عند التطعيم الأول. على سبيل المثال ، يتم استخدام مستحضر منقى أو مُخصب لمستضد PSMA (على سبيل المثال ، PSMA المؤتلف أو الخلايا التي تعبر عن PSMA) لتحصين الفئران داخل الصفاق (IP) ، على الرغم من أن طرق التحصين الأخرى المعروفة لأحد ذوي المهارات العادية في المجال ممكنة أيضًا . يتم حقن مستضد PSMA في توليفة مع مادة مساعدة ، مثل مساعد Freund الكامل ، ويفضل أن يتبع الحقن الأولي التطعيمات المعززة مع مولد الضد في مادة مساعدة ، مثل مساعد Freund غير المكتمل. تتم مراقبة الاستجابة المناعية على مدار بروتوكول التحصين باستخدام عينات البلازما التي تم الحصول عليها ، على سبيل المثال ، من خلال النزيف الرجعي للحجاج. يتم فحص البلازما بواسطة ELISA (كما هو موضح أدناه) ، ويتم استخدام الفئران ذات العيارات الكافية من الغلوبولين المناعي البشري المضاد لـ PSMA للاندماج. يتم تعزيز الفئران عن طريق الوريد بالمستضد قبل 3 أيام من التضحية وإزالة الطحال.

على وجه الخصوص ، يتم إنتاج الأجسام المضادة بواسطة الأورام الهجينة المشار إليها هنا باسم PSMA 3.7 (PTA-3257) ، PSMA 3.8 ، PSMA 3.9 (PTA-3258) ، PSMA 3.11 (PTA-3269) ، PSMA 5.4 (PTA-3268) ، PSMA 7.1 (PTA-3292) ، PSMA 7.3 (PTA-3293) ، PSMA 10.3 (PTA-3347) ، PSMA 1.8.3 (PTA-3906) ، PSMA A3.1.3 (PTA-3904) ، PSMA A3.3.1 (PTA- 3905)، Abgenix 4.248.2 (PTA-4427)، Abgenix 4.360.3 (PTA-4428)، Abgenix 4.7.1 (PTA-4429)، Abgenix 4.4.1 (PTA-4556)، Abgenix 4.177.3 (PTA- 4557)، Abgenix 4.16.1 (PTA-4357)، Abgenix 4.22.3 (PTA-4358)، Abgenix 4.28.3 (PTA-4359)، Abgenix 4.40.2 (PTA-4360)، Abgenix 4.48.3 (PTA- 4361)، Abgenix 4.49.1 (PTA-4362)، Abgenix 4.209.3 (PTA-4365)، Abgenix 4.219.3 (PTA-4366)، Abgenix 4.288.1 (PTA-4367)، Abgenix 4.333.1 (PTA- 4368)، Abgenix 4.54.1 (PTA-4363)، Abgenix 4.153.1 (PTA-4388)، Abgenix 4.232.3 (PTA-4389)، Abgenix 4.292.3 (PTA-4390)، Abgenix 4.304.1 (PTA- 4391) و Abgenix 4.78.1 (PTA-4652) و Abgenix 4.152.1 (PTA-4653). تم إيداع هذه الأورام الهجينة وفقًا لمتطلبات معاهدة بودابست بشأن الاعتراف الدولي بإيداع الكائنات الدقيقة لأغراض إجراءات البراءات لدى المجموعة الأمريكية للثقافة النوعية ("ATCC") ، والتي تحمل العنوان 10801 University Boulevard، Manassas، VA 20110-2209 ، كسلطة إيداع دولية ومنحها تسميات إيداع البراءات المبينة أعلاه وفي الجدول 1.

يوفر الاختراع الحالي أيضًا جزيئات الحمض النووي التي تشفر الأجسام المضادة لـ PSMA والمتجهات التي تشتمل على جزيئات الحمض النووي كما هو موصوف في هذه الوثيقة. يمكن استخدام النواقل الموفرة لتحويل أو نقل الخلايا المضيفة لإنتاج أجسام مضادة لـ PSMA مع خصوصية الأجسام المضادة الموصوفة هنا. في تجسيد مفضل ، سيكون للأجسام المضادة المنتجة خصوصية الأجسام المضادة AB-PG1-XG1-006 ، AB-PG1-XG1-026 ، AB-PG1-XG1-051 ، AB-PG1 ، XG1-069 ، AB-PG1- XG1-077 و PSMA 10.3. في أحد التجسيدات ، يمكن أن تشتمل النواقل على جزيء حمض نووي معزول يشفر السلسلة الثقيلة من الأجسام المضادة المذكورة أعلاه والتي تم ترميزها بواسطة جزيئات حمض نووي تشتمل على منطقة أو مناطق تشفير متواليات الحمض النووي الموضحة كـ SEQ ID NO: 2-7. في نموذج آخر ، يمكن أن تشتمل النواقل على متواليات الحمض النووي التي تشفر السلسلة الخفيفة للأجسام المضادة الموضحة كرقم تعريف التسلسل: 8-13. في نموذج إضافي ، يمكن أن تشتمل نواقل الاختراع على سلسلة ثقيلة ومتوالية خفيفة. في نموذج إضافي ، يتم إعطاء البلازميدات التي تنتج الأجسام المضادة أو شظايا ربط مولد الضد الموصوفة هنا. تشتمل بلازميدات الاختراع على بلازميدات منتقاة من المجموعة التي تتكون من: AB-PG1-XG1-006 سلسلة ثقيلة (رقم تعريف التسلسل: 2) ، سلسلة خفيفة AB-PG1-XG1-006 (رقم تعريف التسلسل: 8) ، AB-PG1 -XG1-026 سلسلة ثقيلة (رقم معرف التسلسل: 3) ، سلسلة خفيفة AB-PG1-XG1-026 (رقم معرف التسلسل: 9) ، سلسلة ثقيلة AB-PG1-XG1-051 (رقم معرف التسلسل: 4) ، AB- سلسلة خفيفة PG1-XG1-051 (رقم معرف التسلسل: 10) ، سلسلة ثقيلة AB-PG1-XG1-069 (رقم معرف التسلسل: 5) ، سلسلة خفيفة AB-PG1-XG1-069 (رقم معرف التسلسل: 11) ، AB -PG1-XG1-077 سلسلة ثقيلة (رقم معرف التسلسل: 6) ، سلسلة خفيفة AB-PG1-XG1-077 (رقم معرف التسلسل: 12) ، سلسلة ثقيلة PSMA 10.3 (رقم معرف التسلسل: 7) ، PSMA 10.3 Kappa ( رقم معرف التسلسل: 13).

يفضل اختيار الجسم المضاد المعزول أو الجزء المرتبط بمولد الضد من حيث قدرته على ربط الخلايا الحية التي تعبر عن PSMA. من أجل إثبات ارتباط الأجسام المضادة وحيدة النسيلة بالخلايا الحية التي تعبر عن PSMA ، يمكن استخدام قياس التدفق الخلوي. على سبيل المثال ، يتم خلط سلالات الخلايا التي تعبر عن PSMA (تنمو في ظل ظروف نمو قياسية) أو خلايا سرطان البروستاتا التي تعبر عن PSMA بتركيزات مختلفة من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة في PBS التي تحتوي على 0.1٪ TWEEN 80 و 20٪ مصل الفأر ، وتحتضن عند 37 درجة مئوية. 1 ساعة. بعد الغسيل ، تتفاعل الخلايا مع الأجسام المضادة IgG الثانوية المضادة للإنسان التي تحمل علامة الفلورسين (إذا تم استخدام الأجسام المضادة البشرية المضادة لـ PSMA) في نفس الظروف مثل تلطيخ الجسم المضاد الأولي. يمكن تحليل العينات عن طريق أداة فارز الخلية المنشطة الفلورية (FACS) باستخدام خصائص التشتت الضوئي والجانبي للبوابة على الخلايا المفردة.يمكن استخدام مقايسة بديلة باستخدام الفحص المجهري الفلوري (بالإضافة إلى أو بدلاً من) مقايسة التدفق الخلوي. يمكن تلطيخ الخلايا تمامًا كما هو موضح أعلاه وفحصها بواسطة الفحص المجهري الفلوري. تسمح هذه الطريقة بتصور الخلايا الفردية ، ولكن قد تقل الحساسية اعتمادًا على كثافة المستضد.

يمكن أن يؤدي ارتباط الجسم المضاد أو الجزء المرتبط بمولد الضد للخلايا الحية التي تعبر عن PSMA إلى تثبيط نمو الخلايا أو التوسط في التحلل الخلوي للخلايا. يمكن تكميل التحلل الخلوي بوساطة أو يمكن التوسط بواسطة الخلايا المستجيبة. في نموذج مفضل ، يتم إجراء التحلل الخلوي في كائن حي ، ويفضل أن يكون أحد الثدييات ، وتكون الخلية الحية عبارة عن خلية ورمية. تتضمن أمثلة الأورام التي يمكن استهدافها بواسطة الأجسام المضادة للاختراع ، أي ورم يُعبر عن PSMA ، مثل البروستاتا والمثانة والبنكرياس والرئة والقولون والكلى والأورام الميلانينية والساركوما. في تجسيد مفضل ، تكون الخلية السرطانية عبارة عن خلية سرطانية في البروستاتا.

يمكن أن يوفر اختبار نشاط التحلل الخلوي للأجسام المضادة في المختبر عن طريق مقايسة إطلاق الكروم فحصًا أوليًا قبل الاختبار في النماذج المجراة. يمكن إجراء هذا الاختبار باستخدام مقايسات إطلاق الكروم القياسية. باختصار ، يمكن تنقية الخلايا متعددة الأشكال (PMN) ، أو غيرها من الخلايا المستجيبة ، من متبرعين أصحاء عن طريق الطرد المركزي بكثافة FICOLL ، متبوعًا بتحليل كريات الدم الحمراء الملوثة. يمكن تعليق PMNs المغسولة في RPMI مع 10 ٪ من مصل العجل الجنيني المعطل بالحرارة وخلطه مع 51 Cr من الخلايا المسمى PSMA ، بنسب مختلفة من الخلايا المؤثرة إلى الخلايا السرطانية (الخلايا المستجيبة: الخلايا السرطانية). يمكن بعد ذلك إضافة IgGs المنقى المضاد لـ PSMA بتركيزات مختلفة. يمكن استخدام IgG غير ذي الصلة كعنصر تحكم سلبي. يمكن إجراء الاختبارات لمدة 0-120 دقيقة عند 37 درجة مئوية. يمكن فحص العينات من أجل التحلل الخلوي عن طريق قياس إطلاق 51 Cr في طاف الثقافة. يمكن أيضًا اختبار الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لـ PSMA في مجموعات مع بعضها البعض لتحديد ما إذا كان التحلل الخلوي معززًا بأجسام مضادة متعددة وحيدة النسيلة.

    • 1) الارتباط بالخلايا الحية التي تعبر عن PSMA
    • 2) تقارب عالٍ من الارتباط بـ PSMA
    • 3) الارتباط بحلقة وصل فريدة على PSMA (للقضاء على احتمال أن تتنافس الأجسام المضادة ذات الأنشطة التكميلية عند استخدامها معًا على الارتباط بنفس الحاتمة)
    • 4) طبع الخلايا التي تعبر عن PSMA
    • 5) التوسط في تثبيط النمو ، البلعمة و / أو قتل الخلايا التي تعبر عن PSMA في وجود الخلايا المستجيبة
    • 6) تعديل (تثبيط أو تعزيز) أنشطة NAALADase ، حمض الفوليك هيدرولاز ، dipeptidyl peptidase IV و / أو-glutamyl hydrolase
    • 7) تثبيط النمو ، توقف دورة الخلية و / أو السمية الخلوية في غياب الخلايا المستجيبة
    • 8) استيعاب PSMA
    • 9) ملزمة إلى حاتمة مطابقة على PSMA
    • 10) الحد الأدنى من التفاعل المتبادل مع الخلايا أو الأنسجة التي لا تعبر عن PSMA و
    • 11) الارتباط التفضيلي للأشكال القاتمة لـ PSMA بدلاً من الأشكال الأحادية لـ PSMA.

    تفي الأجسام المضادة المفضلة في الاختراع بواحد أو أكثر ، ويفضل أن تكون جميعها ، من هذه المعايير. في نموذج معين ، تُستخدم الأجسام المضادة في توليفة ، على سبيل المثال ، كتركيبة صيدلانية تشتمل على اثنين أو أكثر من الأجسام المضادة المختلفة لـ PSMA أو شظايا ربط منها. على سبيل المثال ، يمكن الجمع بين الأجسام المضادة لـ PSMA التي لها أنشطة مختلفة ولكن تكميلية في علاج واحد لتحقيق التأثير العلاجي أو التشخيصي المرغوب. مثال على ذلك هو تركيبة تحتوي على جسم مضاد لـ PSMA يتوسط في قتل الخلايا المستهدفة بفعالية عالية في وجود الخلايا المستجيبة ، جنبًا إلى جنب مع جسم مضاد آخر مضاد لـ PSMA يمنع نمو الخلايا التي تعبر عن PSMA.

    في سمة مفضلة للاختراع ، يرتبط الجسم المضاد أو الجزء المرتبط بمولد الضد بمادة حاتمة مطابقة ضمن المجال خارج الخلية لجزيء PSMA. لتحديد ما إذا كانت الأجسام المضادة البشرية المحددة المضادة لـ PSMA ترتبط بحلقات مطابقة ، يمكن اختبار كل جسم مضاد في فحوصات باستخدام بروتين أصلي (على سبيل المثال ، ترسيب مناعي غير مسبب للتغير الطبيعي ، تحليل التدفق الخلوي لربط سطح الخلية) والبروتين المشوه (على سبيل المثال ، لطخة غربية ، ترسيب مناعي للبروتينات المشوهة). ستشير مقارنة النتائج إلى ما إذا كانت الأجسام المضادة ترتبط بحلقات تكوين. الأجسام المضادة التي ترتبط بالبروتين الأصلي ولكنها لا ترتبط بالبروتين المشوه هي تلك الأجسام المضادة التي تربط الحواتم التوافقية ، وهي أجسام مضادة مفضلة.

    في سمة مفضلة أخرى للاختراع ، يرتبط الجسم المضاد أو الجزء المرتبط بمولد الضد منه بحلقة خاصة باهتة على PSMA. بشكل عام ، ترتبط الأجسام المضادة أو شظايا الارتباط بمولد الضد والتي ترتبط بحلقة خاصة باهتة بشكل تفضيلي ثنائى PSMA بدلاً من مونومر PSMA. لتحديد ما إذا كانت الأجسام المضادة البشرية المحددة المضادة لـ PSMA ترتبط بشكل تفضيلي (على سبيل المثال ، انتقائيًا و / أو على وجه التحديد) بثنائي PSMA ، يمكن اختبار كل جسم مضاد في المقايسات (على سبيل المثال ، الترسيب المناعي متبوعًا بالنشاف الغربي) باستخدام بروتين PSMA ثنائي الأبعاد ومونومري منفصل بروتين PSMA. ستشير مقارنة النتائج إلى ما إذا كانت الأجسام المضادة ترتبط بشكل تفضيلي بالثنائي أو المونومر. الأجسام المضادة التي ترتبط بثنائي PSMA ولكن ليس ببروتين PSMA الأحادي هي الأجسام المضادة المفضلة.

    تشتمل الأجسام المضادة المفضلة على الأجسام المضادة التي تمنع بشكل تنافسي الارتباط النوعي لجسم مضاد ثانٍ إلى الحاتمة المستهدفة على PSMA. لتحديد التثبيط التنافسي ، يمكن استخدام مجموعة متنوعة من المقايسات المعروفة للمهارة العادية في المجال. على سبيل المثال ، يمكن استخدام فحوصات المنافسة المتقاطعة الموضحة في المثالين 4 و 21 لتحديد ما إذا كان الجسم المضاد يثبط بشكل تنافسي الارتباط بـ PSMA بواسطة جسم مضاد آخر. توفر هذه الأمثلة طرقًا تعتمد على الخلية تستخدم قياس التدفق الخلوي أو تحليل ربط الطور الصلب. يمكن أيضًا استخدام الاختبارات الأخرى التي تقيم قدرة الأجسام المضادة على التنافس التبادلي على جزيئات PSMA التي لم يتم التعبير عنها على سطح الخلايا أو في الطور الصلب أو في مرحلة المحلول. يفضل أن تستخدم هذه المقايسات أجهزة PSMA المتعددة الموصوفة هنا.

    بعض الأجسام المضادة المفضلة تمنع بشكل تنافسي الارتباط النوعي لجسم مضاد ثانٍ مع حاتمة الهدف على PSMA بحوالي 10٪ ، 20٪ ، 30٪ ، 40٪ ، 50٪ ، 60٪ ، 70٪ ، 80٪ ، 90٪ ، 95 ٪ أو 99٪. يمكن تقييم التثبيط بنسب مولارية مختلفة أو نسب كتلة ، على سبيل المثال ، يمكن إجراء تجارب ربط تنافسية بضعفين ، 3 أضعاف ، 4 أضعاف ، 5 أضعاف ، 7 أضعاف ، 10 أضعاف أو أكثر من الضرس الزائد من أول جسم مضاد على الجسم المضاد الثاني.

    تشتمل الأجسام المضادة المفضلة الأخرى على الأجسام المضادة التي ترتبط على وجه التحديد (أي بشكل انتقائي) بحلقة على PSMA يحددها الجسم المضاد الثاني. لتحديد الحاتمة ، يمكن للمرء استخدام طرق رسم خرائط حاتمة قياسية معروفة في المجال. على سبيل المثال ، يمكن استخدام شظايا (ببتيدات) من مستضد PSMA (يفضل الببتيدات الاصطناعية) التي تربط الجسم المضاد الثاني لتحديد ما إذا كان الجسم المضاد مرشحًا يربط نفس الحاتمة. بالنسبة للحلقات الخطية ، يتم تصنيع الببتيدات المتداخلة ذات الطول المحدد (على سبيل المثال ، 8 أو أكثر من الأحماض الأمينية). يفضل أن يقابل الببتيدات بحمض أميني واحد ، بحيث يتم تحضير سلسلة من الببتيدات تغطي كل 8 أجزاء من الأحماض الأمينية من تسلسل بروتين PSMA. يمكن تحضير عدد أقل من الببتيدات باستخدام تعويضات أكبر ، على سبيل المثال ، 2 أو 3 أحماض أمينية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تصنيع الببتيدات الأطول (على سبيل المثال ، 9 أو 10 أو 11 مترًا). يمكن تحديد ارتباط الببتيدات بالأجسام المضادة باستخدام المنهجيات القياسية بما في ذلك رنين البلازمون السطحي (BIACORE ™ انظر المثال 22) ومقايسات ELISA. لفحص الحلقات المطابقة ، يمكن استخدام شظايا PSMA الأكبر. تم وصف الطرق الأخرى التي تستخدم قياس الطيف الكتلي لتحديد الحلقات التوافقية ويمكن استخدامها (انظر ، على سبيل المثال ، Baerga-Ortiz et al. ، علم البروتين 11: 1300-1308 ، 2002 والمراجع الواردة فيه). لا تزال هناك طرق أخرى لتحديد الحاتمة متوفرة في الأعمال المرجعية للمختبر القياسية ، مثل الوحدة 6.8 ("اختيار عرض Phage وتحليل حلقات الخلية B") والوحدة 9.8 ("تحديد محددات المستضدات باستخدام مكتبات تجميع الببتيد الاصطناعية") من البروتوكولات الحالية في علم المناعة، كوليجان وآخرون ، محررون ، جون وايلي وأولاده.

    يمكن تأكيد الحواتم من خلال إدخال طفرات نقطية أو عمليات حذف في حاتمة معروفة ، ثم اختبار الارتباط بواحد أو أكثر من الأجسام المضادة لتحديد الطفرات التي تقلل من ارتباط الأجسام المضادة.

    في أحد تجسيدات الاختراع ، يرتبط الجسم المضاد أو الجزء المرتبط بمولد الضد مع PSMA معبرًا عنه في الخلايا. إن الآلية التي يتم من خلالها استيعاب الجسم المضاد أو الجزء المرتبط بمولد الضد مع مولد الضد الغشائي المحدد للبروستات ليست مهمة لممارسة الاختراع الحالي. على سبيل المثال ، يمكن أن يحفز الجسم المضاد أو جزء منه يرتبط بمولد الضد استيعاب PSMA. بدلاً من ذلك ، يمكن أن يكون استيعاب الجسم المضاد أو جزء منه يرتبط بمولد الضد نتيجة الاستيعاب الروتيني لـ PSMA. يمكن استخدام الجسم المضاد أو الجزء المرتبط بمولد الضد في شكل غير معدل ، بمفرده أو مع تركيبات أخرى. بدلاً من ذلك ، يمكن ربط الجسم المضاد أو الجزء المرتبط بمولد الضد بمادة فعالة لقتل الخلايا عند ربط الجسم المضاد أو جزء ربط مولد الضد منه بمستضد غشاء محدد للبروستات وعند استيعاب العامل البيولوجي مع مولد الضد الغشائي المحدد للبروستات. .

    ترتبط الأجسام المضادة لـ PSMA البشرية وفقًا للاختراع الحالي على وجه التحديد بـ PSMA على سطح الخلية و / أو rsPSMA بتقارب شبه نانوي. تحتوي الأجسام المضادة لـ PSMA البشرية وفقًا للاختراع الحالي على ارتباطات ارتباط تبلغ حوالي 1 × 10 9 م أو أقل ، ويفضل حوالي 1 × 10 × 10 م أو أقل ، ويفضل أكثر 1 × 10 × 11 م أو أقل. في نموذج معين ، يكون ألفة الربط أقل من حوالي 5 × 10 10 م.

    يمكن ربط الجسم المضاد بعلامة يمكن اكتشافها أو عامل مضاد للأورام أو جهاز مناعي. يمكن أن تشمل العوامل المضادة للأورام عوامل وعوامل سامة للخلايا تعمل على الأوعية الدموية العصبية للورم. تشمل الواسمات القابلة للكشف ، على سبيل المثال ، الواسمات المشعة أو الفلورية. تشمل العوامل السامة للخلايا النويدات المشعة السامة للخلايا والسموم الكيميائية والسموم البروتينية.

    يُفضل أن يكون النويدات المشعة السامة للخلايا أو نظير العلاج الإشعاعي هو نظير باعث لألفا مثل 225 Ac ، 211 At ، 212 Bi ، 213Bi ، 212 Pb ، 224 Ra أو 223 Ra. بشكل بديل ، قد يكون للنويدات المشعة السامة للخلايا نظيرًا باعثًا لبيتا مثل 186 Rh ، 188 Rh ، 177 Lu ، 90 Y ، 131 I ، 67 CU ، 64 Cu ، 153 Sm أو 166 Ho. علاوة على ذلك ، قد تصدر النويدات المشعة السامة للخلايا إلكترونات أوجيه منخفضة الطاقة وتتضمن النظائر 125 I أو 123 I أو 77 Br.

    تشمل السموم الكيميائية المناسبة أو عوامل العلاج الكيميائي أعضاء عائلة enediyne من الجزيئات ، مثل calicheamicin و esperamicin. يمكن أيضًا أخذ السموم الكيميائية من المجموعة التي تتكون من ميثوتريكسات ، دوكسوروبيسين ، ملفالان ، كلورامبيوسيل ، ARA-C ، فينديزين ، ميتوميسين C ، رابطة الدول المستقلة ، بلاتينيوم ، إيتوبوسيد ، بليوميسين و 5 فلورويوراسيل. تشتمل العوامل الأخرى المضادة للأورام التي يمكن أن ترتبط بالأجسام المضادة لـ PSMA وفقًا للاختراع الحالي على دولاستاتين (براءات الاختراع الأمريكية رقم 6.034.065 و 6.239.104) ومشتقاتها. من الأمور ذات الأهمية الخاصة dolastatin 10 (dolavaline-valine-dolaisoleuine-dolaproine-dolaphenine) ومشتقات auristatin PHE (dolavaline-valine-dolaisoleuine-dolaproine-phenylalanine-methyl ester) (Pettit، G. R. et al.، دواء مضاد للسرطان. 13 (4): 243-277 ، 1998 Woyke ، T. وآخرون ، مضاد للميكروبات. وكلاء Chemother. 45 (12): 3580-3584 ، 2001) ، وأوراستاتين إي وما شابه ذلك. تشتمل السموم الأقل تفضيلًا في التكوينات وطرق الاختراع على الليكتينات السامة والسموم النباتية مثل سموم الريسين والأبرين والموديسين والبوتولينا والدفتيريا. بالطبع ، يمكن أيضًا أن تقترن مجموعات من السموم المختلفة بجزيء واحد من الجسم المضاد وبالتالي استيعاب السمية الخلوية المتغيرة. عوامل العلاج الكيميائي الأخرى معروفة لأولئك المهرة في المجال.

    تتوسط الأشكال المرتبطة بالسموم للأجسام المضادة لـ PSMA الخاصة بالاختراع الحالي في قتل خلايا معينة للخلايا التي تعبر عن PSMA بتركيزات بيكومولار. تُظهر الأجسام المضادة PSMA المرتبطة بالسموم الخاصة بالاختراع الحالي IC50s بتركيزات أقل من حوالي 1 × 10 10 م ، ويفضل أقل من حوالي 1 × 10 11 م ، ويفضل أن تكون أقل من حوالي 1 × 10 12 م. في نموذج معين ، IC50 يتم تحقيقه بتركيز أقل من حوالي 1.5 × 10 −11 م.

    يمكن للوكلاء الذين يعملون على الأوعية الدموية للورم أن يشملوا عوامل ربط التوبولين مثل كومبريستاتين A4 (Griggs et al.، Lancet Oncol.282، 2001) ، أنجيوستاتين وإندوستاتين (تمت مراجعته في روزين ، طبيب الأورام 5:20 ، 2000 ، مدمج بواسطة المرجع هنا) والبروتين المحفز للإنترفيرون 10 (براءة الاختراع الأمريكية رقم 5994292). كما تم التفكير في عدد من العوامل المضادة لتولد الأوعية في التجارب السريرية حاليًا. يشمل الوكلاء الذين يخضعون حاليًا للتجارب السريرية: 2ME2 و Angiostatin و ANGIOZYME و Anti-VEGF RhuMAb و Apra (CT-2584) و AVICINE و Benefin و BMS275291 و Carboxyamidotriazole و CC4047 و CC5013 و CC7085 و CDC801 و CGP-41251 (PKC 4) ، Combretastatin A-4 Prodrug، EMD 121974، Endostatin، Flavopiridol، Genistein (GCP)، Green Tea Extract، IM-862، ImmTher، Interferon alpha، Interleukin-12، IRESSA (ZD1839)، Marimastat، METASTAT (Col-3) ، NEOVASTAT، Octreotide، Paclitaxel، Penicillamine، PHOTOFRIN، PHOTOPOINT، PI-88، Prinomastat (AG-3340)، PTK787 (ZK22584)، RO317453، Solimastat، Squalamine، SU 101، SU 5416، SU-6668، Suradista (FCE) Suramin (Metaret) و Tetrathiomolybdate و Thalidomide و TNP-470 و VITAXIN. تم وصف عوامل إضافية مضادة لتولد الأوعية بواسطة Kerbel، J. Clin. اونكول. 19 (18s): 45s-51s ، 2001 ، والتي تم تضمينها بالإشارة هنا. تشمل مُعدِّلات المناعة المناسبة للاقتران بالأجسام المضادة لـ PSMA α-interferon و γ-interferon وعامل نخر الورم ألفا (TNFα).

    يتم تصور اقتران جزيء ذيفان واحد أو أكثر بالجسم المضاد المضاد لـ PSMA ليشمل العديد من الآليات الكيميائية ، على سبيل المثال الارتباط التساهمي ، الارتباط التقارب ، الإقحام ، تنسيق الارتباط ، والتعقيد. يتم ربط المركبات السامة المستخدمة لتحضير السموم المناعية المضادة لـ PSMA بالأجسام المضادة أو شظايا مرتبطة بـ PSMA بواسطة بروتوكولات قياسية معروفة في المجال.

    يمكن تحقيق الارتباط التساهمي إما عن طريق التكثيف المباشر للسلاسل الجانبية الموجودة أو عن طريق دمج جزيئات التجسير الخارجية. العديد من العوامل ثنائية التكافؤ أو متعددة التكافؤ مفيدة في اقتران جزيئات البروتين ببروتينات أو ببتيدات أو وظائف أمين أخرى ، إلخ. على سبيل المثال ، تمتلئ الأدبيات بعوامل اقتران مثل الكربوديميدات ، وثنائي أيزوسيانات ، وجلوتارالدهيد ، وديازوبنزين ، وهكساميثيلين ديامينس. لا يُقصد من هذه القائمة أن تكون شاملة لعوامل الاقتران المختلفة المعروفة في المجال ولكنها ، بدلاً من ذلك ، نموذجية لعوامل الاقتران الأكثر شيوعًا.

    في النماذج المفضلة ، من المتصور أن المرء قد يرغب أولاً في اشتقاق الجسم المضاد ، ثم ربط مكون الذيفان بالمنتج المشتق. تشمل عوامل الربط المتقاطعة المناسبة للاستخدام بهذه الطريقة ، على سبيل المثال ، بروبيونات SPDP (N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio)) و SMPT و 4-succinimidyl-oxycarbonyl-methyl- (2-pyridyldithio) التولوين.

    بالإضافة إلى ذلك ، يمكن دمج سموم البروتين مع الجسم المضاد لـ PSMA أو جزء ربط PSMA بالطرق الجينية لتكوين بروتين اندماج سموم مناعي هجين. لعمل بروتين سم مناعي اندماج وفقًا للاختراع ، يتم إنشاء جزيء حمض نووي يشفر جسمًا مضادًا مضادًا لـ PSMA ، أو جزء من جسم مضاد لـ PSMA ، أو جسم مضاد لـ PSMA أحادي السلسلة ، أو وحدة فرعية من مضاد- يرتبط الجسم المضاد PSMA بسم بروتيني. تحتوي بروتينات الاندماج هذه على الأقل على عامل استهداف (على سبيل المثال ، وحدة فرعية لجسم مضاد لـ PSMA) وسم من الاختراع ، مرتبط عمليًا. قد تشتمل بروتينات الاندماج أيضًا على متواليات ببتيد إضافية ، مثل فواصل الببتيد التي تربط عامل الاستهداف ومركب السم بشكل فعال ، طالما أن مثل هذه التسلسلات الإضافية لا تؤثر بشكل ملحوظ على أنشطة الاستهداف أو السموم لبروتين الاندماج. يمكن ربط البروتينين بواسطة رابط ببتيد أو مباعد ، مثل ببتيد فاصل جلايسين سيرين ، أو مفصل ببتيد ، كما هو معروف في الفن. وبالتالي ، على سبيل المثال ، يمكن دمج الطرف C لجسم مضاد لـ PSMA أو جزء منه مع الطرف N لجزيء ذيفان البروتين لتكوين سم مناعي يحتفظ بخصائص الارتباط بالجسم المضاد المضاد لـ PSMA. ستكون ترتيبات الاندماج الأخرى معروفة لمن يتمتع بمهارة عادية في المجال.

    للتعبير عن الذيفان المناعي الاندماجي ، يتم إدخال الحمض النووي الذي يشفر بروتين الاندماج في ناقل تعبير وفقًا للطرق القياسية ، للتعبير المستقر عن بروتين الاندماج ، ويفضل في خلايا الثدييات ، مثل خلايا CHO. يمكن عزل بروتين الاندماج وتنقيته من الخلايا أو الثقافة الطافية باستخدام منهجية قياسية ، مثل عمود تقارب PSMA.

    تقترن النويدات المشعة عادة بجسم مضاد عن طريق عملية إزالة معدن ثقيل. على سبيل المثال ، في حالة النويدات المشعة المعدنية ، يتم استخدام خالب ثنائي الوظيفة بشكل شائع لربط النظير بالجسم المضاد أو بروتين آخر مهم. عادةً ، يتم توصيل المستخلِب أولاً بالجسم المضاد ، ويتم ملامسة اتحاد الجسم المضاد المخلبي بالنظير المشع المعدني. تم تطوير عدد من الخلبات ثنائية الوظائف لهذا الغرض ، بما في ذلك سلسلة حمض ثنائي إيثيلين تريامين بينتا أسيتيك (DTPA) من الأحماض الأمينية الموصوفة في براءة الاختراع الأمريكية. الأرقام 5.124.471 و 5.286.850 و 5.434.287 المدرجة هنا بالإشارة. كمثال آخر ، تم وصف عوامل مخلبية ثنائية الوظيفة أساسها حمض الهيدروكساميك في براءة الاختراع الأمريكية. رقم 5،756،825 ، تم دمج محتوياتها هنا. مثال آخر هو العامل المخلب المسمى p-SCN-Bz-HEHA (1،4،7،10،13،16-hexaazacyclo-octadecane-N، N ′، N ″، N ′ ″، N ″ ″، N ″ حمض هكساسيتيك) ديل وآخرون ، جيه ميد. تشيم. 42: 2988 ، 1999) ، وهو مخلب فعال للمعادن الإشعاعية مثل 225 Ac. مثال آخر هو DOTA (1،4،7،10-tetraazacyclodecane N ، N ′ ، N ″ ، N ′ ″ - حمض tetraacetic) ، وهو عامل مخلب ثنائي الوظيفة (انظر McDevitt et al. ، Science 294: 1537-1540 ، 2001) التي يمكن استخدامها بطريقة من خطوتين لوضع العلامات متبوعًا بالاقتران.

    في جانب آخر ، يوفر الاختراع تركيبات تشتمل على جسم مضاد معزول ، أو جسم مضاد مشتق أو مرتبط بشقوق وظيفية أخرى ، أو شظية مرتبطة بمولد الضد منها أو توليفة من واحد أو أكثر من الأجسام المضادة المذكورة أعلاه أو شظايا مرتبطة بمولد الضد منها. تشتمل التركيبات على مادة حاملة أو سواغ أو مثبت مقبول فسيولوجيًا أو صيدلانيًا ممزوجًا بالجسم المضاد المعزول أو الجزء المرتبط بمولد الضد منه. في نموذج مفضل ، تشتمل التكوينات على توليفة من عدة (على سبيل المثال ، اثنان أو أكثر) من الأجسام المضادة المعزولة أو أجزاء مرتبطة بمولد الضد من الاختراع. على نحو مفضل ، يرتبط كل من الأجسام المضادة أو الأجزاء المرتبطة بمولد الضد من التركيبة بحلقة تكوينية مميزة لـ PSMA. في أحد النماذج ، يتم استخدام الأجسام المضادة لـ PSMA ذات الأنشطة التكميلية في توليفة ، على سبيل المثال ، كتركيبة صيدلانية ، تشتمل على اثنين أو أكثر من الأجسام المضادة لـ PSMA.على سبيل المثال ، يمكن دمج الجسم المضاد الذي يتوسط التحلل الخلوي عالي الفعالية للخلايا المستهدفة في وجود الخلايا الفعالة مع جسم مضاد آخر يمنع نمو الخلايا التي تعبر عن PSMA. كما هو مستخدم هنا ، "الخلية المستهدفة" تعني أي خلية غير مرغوب فيها في موضوع (على سبيل المثال ، إنسان أو حيوان) يمكن استهدافها بواسطة تركيبة الاختراع. في التجسيدات المفضلة ، تكون الخلية المستهدفة عبارة عن خلية تعبر عن PSMA أو تفرط في التعبير عنه. تشمل الخلايا التي تعبر عن PSMA عادةً الخلايا السرطانية ، مثل البروستاتا والمثانة والبنكرياس والرئة والكلى وخلايا أورام القولون والأورام الميلانينية والساركوما.

    يمكن أيضًا إعطاء التركيبات الصيدلانية الخاصة بالاختراع في العلاج المركب ، أي ، مع عوامل أخرى. على سبيل المثال ، يمكن أن يشتمل العلاج المركب على تركيبة الاختراع الحالي مع عامل واحد على الأقل مضاد للورم ، أو معدل مناعي ، أو عامل تحفيز مناعي ، أو علاج تقليدي آخر. قد يكون العامل مرتبطًا أو مترافقًا أو يتم تكوينه كجزيء اندماج معاد الاتحاد مع الأجسام المضادة لـ PSMA وفقًا للاختراع الحالي من أجل الاستهداف الموجه للعامل إلى الخلايا التي تعبر عن PSMA.

    يمكن استخدام الأجسام المضادة لـ PSMA الخاصة بالاختراع الحالي كقطعة استهداف لتوصيل الفيروس الانتقائي للنسخ المتماثل إلى الخلايا التي تعبر عن PSMA من أجل علاج الورم. يقتل الفيروس المختص بالنسخ المتماثل مثل المسار p53 الذي يستهدف dl1520 ، ONYX-015 ، الخلايا السرطانية بشكل انتقائي (Biederer، C. et al.، J. Mol. Med. 80 (3): 163-175، 2002).

    كما هو مستخدم هنا ، تشتمل عبارة "مادة حاملة مقبولة صيدلانيًا" أو "مادة حاملة مقبولة من الناحية الفسيولوجية" على أي وجميع الأملاح والمذيبات ووسائط التشتت والطلاءات والعوامل المضادة للبكتيريا والعوامل المضادة للفطريات والعوامل متساوية التوتر وتأخير الامتصاص وما شابه ذلك المتوافقة من الناحية الفسيولوجية. على نحو مفضل ، يكون الناقل مناسبًا للإعطاء عن طريق الوريد أو العضل أو تحت الجلد أو الحقن أو العمود الفقري أو البشرة (على سبيل المثال ، عن طريق الحقن أو التسريب). اعتمادًا على مسار الإعطاء ، يمكن تغليف المركب النشط ، أي الجسم المضاد في مادة لحماية المركب من تأثير الأحماض والظروف الطبيعية الأخرى التي قد تؤدي إلى تعطيل نشاط المركب.

    عند إعطائها ، يتم تطبيق المستحضرات الصيدلانية للاختراع بكميات مقبولة صيدلانيًا وفي تركيبات مقبولة صيدلانيًا. المصطلح "مقبول صيدلانيًا" يعني مادة غير سامة لا تتداخل مع فعالية النشاط البيولوجي للمكونات النشطة. قد تحتوي هذه المستحضرات بشكل روتيني على أملاح ، وعوامل مانعة للتسرب ، ومواد حافظة ، وناقلات متوافقة ، وعوامل علاجية أخرى اختياريًا ، مثل عوامل تقوية المناعة التكميلية بما في ذلك المواد المساعدة ، والكيموكينات ، والسيتوكينات. عند استخدامها في الطب ، يجب أن تكون الأملاح مقبولة صيدلانيًا ، ولكن يمكن استخدام الأملاح غير المقبولة صيدلانيًا بشكل ملائم لتحضير أملاح مقبولة صيدلانيًا منها ولا يتم استبعادها من نطاق الاختراع.

    يحتفظ الملح بالنشاط البيولوجي المطلوب للمركب الأصلي ولا ينقل أي تأثيرات سمية غير مرغوب فيها (انظر على سبيل المثال ، Berge، S.M، et al. (1977) J. فارم. علوم. 66: 1-19). من أمثلة هذه الأملاح أملاح الإضافة الحمضية وأملاح إضافة القاعدة. تشمل أملاح إضافة الأحماض تلك المشتقة من الأحماض غير العضوية غير السامة ، مثل الهيدروكلوريك ، والنتريك ، والفوسفوريك ، والكبريتيك ، والهيدروبروميك ، والفوسفوريك ، والفوسفور وما شابه ذلك ، وكذلك من الأحماض العضوية غير السامة مثل الأحماض الأليفاتية الأحادية الكربوكسيلية والأحماض الفينيلية المستبدلة. ، أحماض ألكانويك هيدروكسي ، أحماض عطرية ، أحماض سلفونيك الأليفاتية والعطرية وما يماثلها. تشمل أملاح الإضافة الأساسية تلك المشتقة من معادن الأرض القلوية ، مثل الصوديوم والبوتاسيوم والمغنيسيوم والكالسيوم وما شابه ، وكذلك من الأمينات العضوية غير السامة ، مثل N و N′-dibenzylethylenediamine و N-methylglucamine و chioroprocaine و choline و diethanolamine ، إيثيلين ديامين ، بروكايين وما شابه.

    يمكن دمج تركيبة الجسم المضاد المضاد لـ PSMA ، إذا رغبت في ذلك ، مع مادة حاملة مقبولة صيدلانيًا. المصطلح "مادة حاملة مقبولة صيدلانيًا" كما هو مستخدم هنا يعني واحدًا أو أكثر من مواد الحشو الصلبة أو السائلة المتوافقة أو المواد المخففة أو المواد المغلفة المناسبة للإعطاء البشري. يشير مصطلح "ناقل" إلى مكون عضوي أو غير عضوي ، طبيعي أو اصطناعي ، يتم دمجه مع المكون النشط لتسهيل التطبيق. كما أن مكونات التركيبات الصيدلانية قادرة أيضًا على الاختلاط مع جزيئات الاختراع الحالي ، ومع بعضها البعض ، بطريقة لا يوجد بها تفاعل من شأنه أن يضعف إلى حد كبير الفعالية الصيدلانية المرغوبة.

    قد تحتوي التركيبات الصيدلانية على عوامل تنظيم مناسبة ، بما في ذلك: حمض الخليك في ملح حامض الستريك في ملح حمض البوريك في ملح وحمض الفوسفوريك في ملح.

    قد تحتوي التركيبات الصيدلانية أيضًا ، بشكل اختياري ، على مواد حافظة مناسبة ، مثل: benzalkonium chloride chlorobutanol parabens و thimerosal.

    يمكن تقديم التركيبات الصيدلانية بشكل ملائم في صورة وحدة جرعة ويمكن تحضيرها بأي من الطرق المعروفة في فن الصيدلة. تشتمل جميع الطرق على خطوة ربط العامل النشط بحامل يشكل مكونًا إضافيًا واحدًا أو أكثر. بشكل عام ، يتم تحضير التركيبات عن طريق ربط المركب النشط بشكل موحد ووثيق مع مادة حاملة سائل ، أو مادة حاملة صلبة مقسمة بدقة ، أو كليهما ، ثم تشكيل المنتج ، إذا لزم الأمر.

    تشتمل التركيبات المناسبة للإعطاء بالحقن بشكل ملائم على مستحضر مائي معقم أو غير مائي من الأجسام المضادة لـ PSMA ، ويفضل أن يكون متساوي التوتر مع دم المتلقي. يمكن صياغة هذا المستحضر وفقًا للطرق المعروفة باستخدام عوامل تشتيت أو ترطيب مناسبة وعوامل تعليق. يمكن أيضًا أن يكون المستحضر القابل للحقن المعقم عبارة عن محلول معقم قابل للحقن أو معلق في مادة مخففة أو مذيب غير سامة مقبولة حقناً ، على سبيل المثال ، كمحلول في 1،3-بيوتان ديول. من بين المركبات والمذيبات المقبولة التي يمكن استخدامها الماء ، ومحلول رينجر ، ومحلول كلوريد الصوديوم متساوي التوتر. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام الزيوت المعقمة والثابتة بشكل تقليدي كوسيط مذيب أو معلق. لهذا الغرض ، يمكن استخدام أي زيت ثابت لطيف بما في ذلك أحادي أو ثنائي جليسريد صناعي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الأحماض الدهنية مثل حمض الأوليك في تحضير الحقن. يمكن العثور على تركيبات حاملة مناسبة للإعطاء عن طريق الفم ، وتحت الجلد ، وريديًا ، وعضليًا ، وما إلى ذلك في العلوم الصيدلانية في ريمنجتون، شركة ماك للنشر ، إيستون ، بنسلفانيا.

    يمكن تحضير المركبات النشطة باستخدام ناقلات تحمي المركب من الإطلاق السريع ، مثل تركيبة الإطلاق الخاضعة للرقابة ، بما في ذلك الغرسات ، والبقع عبر الجلد ، وأنظمة التوصيل ذات الكبسولات الدقيقة. يمكن استخدام البوليمرات القابلة للتحلل الحيوي والمتوافقة حيويًا ، مثل أسيتات فينيل الإيثيلين ، وبوليانهيدريد ، وحمض بولي جليكوليك ، والكولاجين ، والبولي أورثويستر ، وحمض متعدد اللاكتيك. العديد من الطرق لتحضير مثل هذه التركيبات مسجلة ببراءة اختراع أو معروفة بشكل عام لأولئك المهرة في المجال. انظر ، على سبيل المثال ، أنظمة توصيل الأدوية ذات الإطلاق المستدام والخاضع للرقابة، جي آر روبنسون ، محرر ، مارسيل ديكر ، نيويورك ، 1978.

    يمكن إعطاء علاجات الاختراع بأي طريق تقليدي ، بما في ذلك الحقن أو التسريب التدريجي بمرور الوقت. قد يكون الإعطاء ، على سبيل المثال ، عن طريق الفم أو في الوريد أو داخل الصفاق أو في العضل أو داخل التجويف أو داخل الورم أو عبر الجلد. عند استخدام الأجسام المضادة علاجيًا ، تشمل طرق الإعطاء المفضلة في الوريد والهباء الرئوي. تقنيات تحضير أنظمة توصيل الهباء الجوي المحتوية على أجسام مضادة معروفة جيدًا لمن يتمتعون بالمهارة في المجال. بشكل عام ، يجب أن تستخدم هذه الأنظمة المكونات التي لن تضر بشكل كبير بالخصائص البيولوجية للأجسام المضادة ، مثل قدرة الربط المظلي (انظر ، على سبيل المثال ، Sciarra and Cutie ، "الهباء الجوي" ، في العلوم الصيدلانية في ريمنجتون ، الطبعة الثامنة عشر ، 1990 ، ص 1694-1712 مدمجة بالإشارة). يمكن لأصحاب المهارة في المجال تحديد المعلمات والظروف المختلفة لإنتاج رذاذ الجسم المضاد بسهولة دون اللجوء إلى تجارب لا داعي لها.

    تدار تركيبات الاختراع بكميات فعالة. "الكمية الفعالة" هي تلك الكمية من تركيبة الجسم المضاد المضاد لـ PSMA التي تنتج وحدها ، أو جنبًا إلى جنب مع الجرعات الإضافية ، الاستجابة المرغوبة ، على سبيل المثال يعالج ورم خبيث في الموضوع. قد ينطوي هذا فقط على إبطاء تقدم المرض مؤقتًا ، على الرغم من أنه من الأفضل بشكل أكبر ، أنه ينطوي على وقف تطور المرض بشكل دائم. يمكن مراقبة ذلك بالطرق الروتينية. يمكن أن تؤدي الاستجابة المرغوبة لعلاج المرض أو الحالة أيضًا إلى تأخير ظهور المرض أو الحالة أو حتى منعه.

    ستعتمد هذه المبالغ ، بالطبع ، على الحالة المعينة التي يتم علاجها ، وشدة الحالة ، ومعايير المريض الفردية بما في ذلك العمر ، والحالة البدنية ، والحجم والوزن ، ومدة العلاج ، وطبيعة العلاج المتزامن (إن وجد) ، والمسار المحدد للإدارة والعوامل المماثلة ضمن معرفة وخبرة الممارس الصحي. هذه العوامل معروفة جيدًا لأصحاب المهارة العادية في الفن ويمكن معالجتها بما لا يزيد عن التجريب الروتيني. يفضل عمومًا استخدام جرعة قصوى من المكونات الفردية أو مجموعات منها ، أي أعلى جرعة آمنة وفقًا لتقدير طبي سليم. سيفهم أصحاب المهارة العادية في المجال ، مع ذلك ، أن المريض قد يصر على جرعة أقل أو جرعة مقبولة لأسباب طبية أو نفسية أو لأي أسباب أخرى تقريبًا.

    يفضل أن تكون التركيبات الصيدلانية المستخدمة في الطرق السابقة معقمة وتحتوي على كمية فعالة من الأجسام المضادة لـ PSMA لإنتاج الاستجابة المرغوبة في وحدة وزن أو حجم مناسب للإعطاء للمريض. يمكن قياس الاستجابة ، على سبيل المثال ، عن طريق تحديد التأثيرات الفسيولوجية لتكوين الجسم المضاد المضاد لـ PSMA ، مثل تراجع الورم أو تقليل أعراض المرض. ستعرف المقايسات الأخرى لأحد أصحاب المهارة العادية في الفن ويمكن استخدامها لقياس مستوى الاستجابة.

    يمكن اختيار جرعات الأجسام المضادة لـ PSMA التي يتم إعطاؤها للموضوع وفقًا لمعايير مختلفة ، ولا سيما وفقًا لطريقة الإعطاء المستخدمة وحالة الشخص. تشمل العوامل الأخرى فترة العلاج المطلوبة. في حالة عدم كفاية الاستجابة في موضوع ما عند الجرعات الأولية المطبقة ، يمكن استخدام جرعات أعلى (أو جرعات أعلى بشكل فعال من خلال طريق توصيل مختلف وأكثر محلية) إلى الحد الذي يسمح به تحمل المريض.

    بشكل عام ، يمكن أن تتراوح الجرعات من حوالي 10 ميكروجرام / كجم إلى حوالي 100000 ميكروجرام / كجم. بناءً على التركيب ، يمكن إعطاء الجرعة باستمرار ، مثل المضخة المستمرة ، أو على فترات دورية. يمكن تحديد الفترات الزمنية المرغوبة للجرعات المتعددة لتركيبة معينة دون إجراء تجارب لا داعي لها بواسطة شخص ماهر في المجال. البروتوكولات الأخرى الخاصة بإعطاء تركيبات الأجسام المضادة لـ PSMA ستكون معروفة لأحد أصحاب المهارة العادية في المجال ، حيث تختلف كمية الجرعة وجدول الإعطاء ومواقع الإعطاء وطريقة الإعطاء وما شابه عن السابق.

    بشكل عام ، يمكن أن تتراوح جرعات النويدات المشعة التي يتم توصيلها بواسطة الأجسام المضادة لـ PSMA الخاصة بالاختراع من حوالي 0.01 ميكرو مولتري / كجم إلى حوالي 10 ميكروليتر مكعب / كجم. ويفضل أن تتراوح جرعة النويدات المشعة من حوالي 0.1 ميكروليتر / كجم إلى حوالي 1.0 ميكروليتر مكعب / كجم. يمكن تحديد الجرعة المثلى لنظير معين بشكل تجريبي عن طريق تجارب معايرة روتينية بسيطة معروفة جيدًا لأحد ذوي المهارات العادية في المجال.

    إعطاء تركيبات الأجسام المضادة لـ PSMA للثدييات بخلاف البشر ، على سبيل المثال لأغراض الاختبار أو لأغراض العلاج البيطري ، يتم إجراؤها إلى حد كبير في نفس الظروف الموضحة أعلاه.

    التركيبات (الأجسام المضادة لـ PSMA ومشتقاتها / اتحاداتها) من الاختراع الحالي لها أدوات تشخيصية وعلاجية في المختبر وفي الجسم الحي. على سبيل المثال ، يمكن إعطاء هذه الجزيئات للخلايا في المزرعة ، على سبيل المثال في المختبر أو خارج الجسم الحي ، أو في موضوع ما ، على سبيل المثال ، في الجسم الحي ، لعلاج أو منع أو تشخيص مجموعة متنوعة من الاضطرابات. كما هو مستخدم هنا ، فإن المصطلح "موضوع" مقصود به أن يشمل البشر والحيوانات غير البشرية. تشمل الموضوعات المفضلة مريضًا بشريًا يعاني من اضطراب يتميز بالتعبير ، عادةً التعبير المنحرف (على سبيل المثال ، الإفراط في التعبير) عن PSMA.

    يتعلق أحد جوانب الاختراع الحالي بطريقة للكشف عن الخلايا السرطانية أو أجزاء منها في عينة بيولوجية (على سبيل المثال ، العينات النسيجية أو الخلوية والخزعات وما شابه ذلك) ، وعلى وجه الخصوص ، للتمييز بين الأورام الخبيثة والأنسجة غير الطبيعية. الأورام الخبيثة. تتضمن هذه الطريقة توفير جسم مضاد أو جزء منه أو مسبار أو رابط رابط لمولد الضد ، والذي يرتبط بمجال خارج الخلية لـ PSMA لهذه الخلايا ، على سبيل المثال ، جسم مضاد لـ PSMA. يرتبط الجسم المضاد المضاد لـ PSMA بعلامة تسمح باكتشاف الخلايا أو أجزاء منها (على سبيل المثال ، PSMA أو أجزاء منها المحررة من هذه الخلايا السرطانية) عند ربط الجسم المضاد المضاد لـ PSMA بالخلايا أو أجزاء منها. يتم ملامسة العينة البيولوجية مع الجسم المضاد المضاد لـ PSMA في ظل ظروف فعالة للسماح بربط الجسم المضاد المضاد لـ PSMA بالمجال خارج الخلية لـ PSMA لأي من الخلايا أو أجزاء منها في العينة البيولوجية. يتم الكشف عن وجود أي خلايا أو أجزاء منها في العينة البيولوجية عن طريق الكشف عن الملصق. في أحد الأشكال المفضلة ، يتم إجراء التلامس بين الجسم المضاد المضاد لـ PSMA والعينة البيولوجية في حيوان ثديي حي ويتضمن إعطاء الجسم المضاد المضاد لـ PSMA للثدييات في ظل ظروف تسمح بربط الجسم المضاد المضاد لـ PSMA مع PSMA لأي من الخلايا أو أجزاء منها في العينة البيولوجية. مرة أخرى ، يمكن تنفيذ مثل هذه الإدارة بأي طريقة مناسبة معروفة لشخص ذو مهارة عادية في المجال.

    بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الأجسام المضادة لـ PSMA الخاصة بالاختراع الحالي في تقنيات التألق المناعي لفحص عينات الأنسجة البشرية والخلية والسوائل الجسدية. في بروتوكول نموذجي ، يتم تجفيف الشرائح التي تحتوي على أقسام ناظمة البرد من عينات خزعة الأنسجة المجمدة وغير المثبتة أو المسحات الخلوية بالهواء ، وتثبيت الفورمالين أو الأسيتون ، وتحضينها مع تحضير الجسم المضاد أحادي النسيلة في غرفة مرطبة في درجة حرارة الغرفة. يتم بعد ذلك غسل الشرائح واحتضانها مع تحضير جسم مضاد ثانوي موجه ضد الجسم المضاد أحادي النسيلة ، وعادة ما يكون نوعًا من الغلوبولين المناعي المضاد للفأر إذا كانت الأجسام المضادة أحادية النسيلة المستخدمة مشتقة من اندماج الخلايا الليمفاوية في طحال الفأر وخط خلية الورم النخاعي الفأري . يتم تمييز هذا الجسم المضاد الثانوي بمركب ، على سبيل المثال رودامين أو فلورسين أيزوثيوسيانات ، يتألق عند طول موجي معين. يتم بعد ذلك تحديد نمط التلوين والشدة داخل العينة عن طريق الفحص المجهري للضوء الفلوريسنت ويتم تسجيله بشكل اختياري فوتوغرافيًا.

    كبديل آخر ، يمكن استخدام تحليل صورة مضان محسّن بالكمبيوتر أو قياس التدفق الخلوي لفحص عينات الأنسجة أو الخلايا المقشرة ، أي مستحضرات أحادية الخلية من خزعات شفط من الأورام باستخدام الأجسام المضادة لـ PSMA لهذا الاختراع. تكون الأجسام المضادة لـ PSMA الواردة في الاختراع مفيدة بشكل خاص في تحديد كمية خلايا الورم الحية ، أي مستحضرات أحادية الخلية من خزعات شفط من أورام البروستاتا بواسطة محلل صورة مضان محسّن بالكمبيوتر أو بمقياس التدفق الخلوي. تكون الأجسام المضادة الواردة في الاختراع مفيدة بشكل خاص في مثل هذه الاختبارات للتمييز بين أورام البروستاتا الحميدة والخبيثة حيث يتم التعبير عن بروتين PSMA الذي ترتبط به الأجسام المضادة لـ PSMA بكميات متزايدة بواسطة الأورام الخبيثة مقارنة بأورام البروستاتا الحميدة. قد توفر النسبة المئوية لتعداد الخلايا الإيجابية لـ PSMA ، بمفردها أو بالاشتراك مع تحديد سمات أخرى للخلايا (على سبيل المثال ، ploidy DNA لهذه الخلايا) ، بالإضافة إلى ذلك ، معلومات تنبؤية مفيدة للغاية من خلال توفير مؤشر مبكر لتطور المرض.

    في نموذج بديل آخر ، يمكن استخدام الأجسام المضادة للاختراع الحالي في توليفة مع أجسام مضادة أخرى معروفة لتوفير معلومات إضافية بخصوص النمط الظاهري الخبيث للسرطان.

    يمكن استخدام طريقة الاختراع الحالي لفحص المرضى بحثًا عن أمراض مرتبطة بوجود خلايا سرطانية أو أجزاء منها. بدلاً من ذلك ، يمكن استخدامه لتحديد تكرار مثل هذه الأمراض ، خاصةً عندما يكون المرض موضعيًا في مادة بيولوجية معينة للمريض. على سبيل المثال ، قد يحدث تكرار لمرض البروستاتا في الحفرة البروستاتية بعد استئصال البروستاتا الجذري. باستخدام طريقة الاختراع الحالي ، يمكن اكتشاف هذا التكرار عن طريق إعطاء جسم مضاد ذو علامات إشعاعية قصيرة المدى للثدييات ثم الكشف عن الملصق عن طريق المستقيم ، على سبيل المثال باستخدام مسبار كاشف عبر المستقيم.

    بدلاً من ذلك ، يمكن إجراء خطوة الاتصال في عينة من المصل أو البول أو سوائل الجسم الأخرى ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر السائل المنوي ، والسائل البروستاتي ، والقذف ، وما شابه ، مثل اكتشاف وجود PSMA في سائل الجسم . عندما يتم إجراء الاتصال في عينة مصل أو بول ، فمن المفضل أن يتعرف العامل البيولوجي إلى حد كبير على عدم وجود مستضدات منتشرة في الدم بخلاف PSMA. نظرًا لأن الخلايا السليمة لا تفرز أو تفرز PSMA في البيئة خارج الخلية ، فإن اكتشاف PSMA في المصل أو البول أو سوائل الجسم الأخرى يشير عمومًا إلى أن الخلايا يتم تحللها أو التخلص منها. وبالتالي ، يمكن استخدام العوامل والطرق البيولوجية للاختراع الحالي لتحديد فعالية بروتوكول علاج السرطان من خلال مراقبة مستوى PSMA في المصل أو البول أو سوائل الجسم الأخرى.

    في تجسيد مفضل بشكل خاص لطريقة الكشف عن الخلايا السرطانية وفقًا للاختراع الحالي ، ترتبط الأجسام المضادة لـ PSMA أو جزء منها يرتبط بمولد الضد بمولد الضد الغشائي المحدد للبروستات في هذه الخلايا. مرة أخرى ، يرتبط العامل البيولوجي بعلامة فعالة للسماح باكتشاف الخلايا أو أجزاء منها عند ربط العامل البيولوجي بالعامل البيولوجي واستيعاب العامل البيولوجي مع مستضد غشاء البروستاتا المحدد.

    تشمل العوامل البيولوجية المناسبة للكشف عن الخلايا السرطانية الأجسام المضادة لـ PSMA ، مثل الأجسام المضادة أحادية النسيلة أو متعددة النسيلة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام شظايا الجسم المضاد ، والأجسام المضادة النصفية ، والمشتقات الهجينة ، والمجسات ، والتركيبات الجزيئية الأخرى. هذه العوامل البيولوجية ، مثل الأجسام المضادة ، وشظايا ارتباط مولد الضد منها ، أو المسابير ، أو الروابط ، ترتبط بالمجالات خارج الخلية لمولدات المضادات الغشائية المحددة للبروستات أو أجزاء منها في الخلايا السرطانية.نتيجة لذلك ، لا ترتبط العوامل البيولوجية بالخلايا الثابتة أو الخلايا التي تتعرض نطاقات المستضدات داخل الخلايا إلى البيئة خارج الخلية فقط. وبالتالي ، فإن ارتباط العوامل البيولوجية يتركز في المناطق التي توجد بها خلايا البروستاتا ، بغض النظر عما إذا كانت هذه الخلايا ثابتة أو غير مثبتة ، أو قابلة للحياة ، أو نخرية. بالإضافة إلى ذلك أو بدلاً من ذلك ، ترتبط هذه العوامل البيولوجية بمستضدات غشاء معينة للبروستاتا أو أجزاء منها في تضخم طبيعي حميد ، وبدرجة أكبر في الخلايا السرطانية.

    يمكن أيضًا استخدام الأجسام المضادة أو الأجزاء المرتبطة بمولد الضد في علاج السرطان في الجسم الحي. يمكن استخدام الأجسام المضادة بمفردها أو ربطها تساهميًا ، إما بشكل مباشر أو عبر رابط ، بمركب يقتل و / أو يمنع تكاثر الخلايا أو الأنسجة الخبيثة بعد إعطاء الاتحادات وتوطينها. عندما يتم استخدام الجسم المضاد بمفرده ، فإنه قد يتوسط في تدمير الورم عن طريق التثبيت المكمل أو السمية الخلوية المعتمدة على الجسم المضاد. بدلاً من ذلك ، يمكن إعطاء الجسم المضاد في تركيبة مع دواء العلاج الكيميائي لإحداث تأثيرات علاجية تآزرية (Baslya and Mendelsohn ، 1994 الدقة سرطان الثدي. والعلاج 29: 127-138). يمكن ربط مجموعة متنوعة من أنواع المواد المختلفة مباشرة بالجسم المضاد من أجل الاستخدامات العلاجية ، بما في ذلك المعادن المشعة والنظائر غير المعدنية ، وأدوية العلاج الكيميائي ، والسموم ، وما إلى ذلك كما هو موصوف أعلاه ومعروف في المجال (انظر ، على سبيل المثال ، Vitetta و Uhr ، 1985 ، Annu. القس إمونول. 3:197).

    يمكن أيضًا إعطاء الأجسام المضادة أو شظايا الارتباط بمولد الضد من الاختراع جنبًا إلى جنب مع المتمم. وفقًا لذلك ، في نطاق الاختراع ، توجد تركيبات تشتمل على أجسام مضادة أو شظايا مرتبطة بمولد الضد منها ومصل أو مكمل. هذه التركيبات مفيدة في أن المكمل يقع على مقربة من الأجسام المضادة البشرية أو شظايا ربط مولد الضد منها. بشكل بديل ، يمكن إعطاء الأجسام المضادة أو شظايا الارتباط بمولد الضد من الاختراع والمكمل أو المصل بشكل منفصل.

    يمكن إعطاء الأجسام المضادة بواحد أو أكثر من عوامل تنشيط المناعة للحث أو تعزيز الاستجابة المناعية ، مثل IL-2 وأوليغنوكليوتيدات تحفيز المناعة (على سبيل المثال ، تلك التي تحتوي على أشكال CpG). تحفز عوامل التحفيز المناعي المفضلة أذرعًا معينة لجهاز المناعة ، مثل الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) التي تتوسط في التسمم الخلوي المعتمد على الجسم المضاد (ADCC).

    يمكن إعطاء المستضدات ، مثل ثنائيات PSMA الموصوفة هنا ، مع واحد أو أكثر من المواد المساعدة لتحفيز أو تعزيز الاستجابة المناعية. المادة المساعدة هي مادة تقوي الاستجابة المناعية. المواد المساعدة على اختلاف أنواعها معروفة جيدًا في المجال. تتضمن الأمثلة المحددة للمواد المساعدة صابونين أحادي الفسفوريل أ (MPL ، سميث كلاين بيتشام) بما في ذلك أليغنوكليوتيدات QS21 (SmithKline Beecham) المحفز المناعي (على سبيل المثال ، CpG oligonucleotides الموصوفة بواسطة Kreig et al.، Nature 374: 546-9، 1995) MONTANIDE فيتامين E ومستحلبات الماء في الزيت المختلفة المحضرة من الزيوت القابلة للتحلل الحيوي مثل سكوالين و / أو توكوفيرول ، Quil A ، Ribi Detox ، CRL-1005 ، L-121 ، وتوليفات منها.

    يمكن أيضًا إعطاء العوامل الأخرى التي تحفز الاستجابة المناعية للموضوع لمستضدات PSMA المتعددة. على سبيل المثال ، تعتبر السيتوكينات مفيدة أيضًا في بروتوكولات التطعيم نتيجة لخصائصها التنظيمية للخلايا الليمفاوية. العديد من السيتوكينات المفيدة لمثل هذه الأغراض سيعرفها أحد أصحاب المهارة العادية في المجال ، بما في ذلك إنترلوكين 2 (IL-2) IL-4 IL-5 IL-12 ، والذي ثبت أنه يعزز التأثيرات الوقائية للقاحات (انظر ، على سبيل المثال ، علم 268: 1432-1434 ، 1995) تركيبات GM-CSF IL-15 IL-18 منها وما شابه ذلك. وهكذا يمكن أن تدار السيتوكينات مع الأجسام المضادة ، والمستضدات ، والكيموكينات و / أو المواد المساعدة لزيادة الاستجابة المناعية.

    تشمل المواد الكيميائية المفيدة في زيادة الاستجابات المناعية على سبيل المثال لا الحصر SLC و ELC و MIP3α و MIP3β و IP-10 و MIG وتوليفات منها.

    يمكن استخدام الأجسام المضادة أو شظايا الارتباط بمولد الضد من الاختراع الحالي بالاقتران مع طرق العلاج العلاجية الأخرى. تشمل هذه العلاجات الأخرى الجراحة والإشعاع والجراحة البردية والعلاج الحراري والعلاج الهرموني والعلاج الكيميائي واللقاحات والعلاجات المناعية الأخرى.

    يشمل الاختراع الحالي أيضًا طريقة تتضمن استخدام الأجسام المضادة أو شظايا مرتبطة بمولد الضد من أجل الوقاية. على سبيل المثال ، يمكن استخدام هذه المواد لمنع أو تأخير تطور أو تطور السرطان.

    استخدام علاج السرطان في الاختراع الحالي له عدد من الفوائد. نظرًا لأن الأجسام المضادة لـ PSMA أو شظايا مرتبطة بمولد الضد وفقًا للاختراع الحالي تستهدف بشكل مفضل خلايا سرطان البروستاتا ، يتم الحفاظ على الأنسجة الأخرى. نتيجة لذلك ، يكون العلاج بهذه العوامل البيولوجية أكثر أمانًا ، خاصة للمرضى المسنين. من المتوقع أن تكون المعالجة وفقًا للاختراع الحالي فعالة بشكل خاص ، لأنها توجه مستويات عالية من الأجسام المضادة لـ PSMA أو شظايا مرتبطة بمولد الضد إلى نخاع العظم والعقد الليمفاوية حيث تسود نقائل سرطان البروستات. علاوة على ذلك ، تميل مواقع الورم لسرطان البروستاتا إلى أن تكون صغيرة الحجم ، وبالتالي يسهل تدميرها بواسطة العوامل السامة للخلايا. يمكن مراقبة العلاج وفقًا للاختراع الحالي بشكل فعال مع المعلمات السريرية مثل مستضد البروستات المحدد في الدم و / أو السمات المرضية لسرطان المريض ، بما في ذلك المرحلة ، درجة غليسون ، الغزو خارج المحفظة ، المنوي ، الحويصلة أو الغزو حول العصب ، هوامش إيجابية ، الليمفاوية المتضمنة العقد ، وما إلى ذلك ، بدلاً من ذلك ، يمكن استخدام هذه المعلمات للإشارة إلى متى يجب استخدام هذه المعالجة.

    نظرًا لأن الأجسام المضادة أو الأجزاء المرتبطة بمولد الضد من الاختراع الحالي ترتبط بالخلايا الحية ، فإن الطرق العلاجية التي تستخدم هذه العوامل البيولوجية تكون أكثر فاعلية من تلك التي تستهدف الخلايا المتحللة. لنفس الأسباب ، تم تحسين طرق التشخيص والتصوير التي تحدد موقع الخلايا الحية الطبيعية أو الحميدة المفرطة التنسج أو السرطانية عن طريق استخدام الأجسام المضادة أو شظايا الارتباط بمولد الضد وفقًا للاختراع الحالي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تكون القدرة على التفريق بين الخلايا الحية والميتة مفيدة ، خاصة لمراقبة فعالية نظام علاج معين.

    كما يوجد ضمن نطاق الاختراع أطقم تشتمل على تركيبات الاختراع وتعليمات الاستخدام. يمكن أن تحتوي المجموعات أيضًا على كاشف إضافي واحد على الأقل ، مثل المكمل ، أو واحد أو أكثر من الأجسام المضادة الإضافية للاختراع (على سبيل المثال ، جسم مضاد له نشاط تكميلي يرتبط بحلقة في مستضد PSMA متميز عن الجسم المضاد الأول). يمكن أن تشتمل المجموعات الأخرى على أجهزة PSMA المتعددة الموصوفة أدناه.

    يمكن تحضير مجموعات تحتوي على الأجسام المضادة أو شظايا مرتبطة بمولد الضد من الاختراع من أجل التشخيص المختبري والتشخيص و / أو مراقبة السرطان من خلال الطرق المناعية والخلوية المناعية والطرق المناعية الموصوفة أعلاه. يمكن تعبئة مكونات المجموعات إما في وسط مائي أو في صورة مجففة بالتجميد. عند استخدام الأجسام المضادة أو شظايا ربط مولد الضد في المجموعات في شكل اتحادات يتم فيها إرفاق جزء ملصق ، مثل إنزيم أو أيون معدني مشع ، يمكن توفير مكونات هذه الاتحادات إما في شكل مترافق بالكامل ، في شكل وسائط أو كقطع منفصلة يتم تصريفها من قبل المستخدم أو المجموعة.

    قد يشتمل الطقم على مادة حاملة يتم تجزئتها لتستقبل في مكان محصور داخل حاوية واحدة أو أكثر أو سلسلة من وسائل الحاوية مثل أنابيب الاختبار ، أو القوارير ، أو القوارير ، أو الزجاجات ، أو المحاقن ، أو ما شابه ذلك. قد تحتوي الوسيلة الأولى من الحاوية المذكورة أو سلسلة من وسائل الحاوية على واحد أو أكثر من الأجسام المضادة لـ PSMA أو شظايا مرتبطة بمولد الضد أو PSMA. حاوية ثانية تعني أو سلسلة من وسائل الحاوية قد تحتوي على ملصق أو وسيط ملصق رابط قادر على الارتباط بالأجسام المضادة الأولية المضادة لـ PSMA (أو جزء منها).

    يمكن تحضير مجموعات للاستخدام في توطين الورم في الجسم الحي وطريقة العلاج التي تحتوي على الأجسام المضادة لـ PSMA أو شظايا مرتبطة بمولد الضد مرتبطة بمركبات أو مواد أخرى. يمكن تعبئة مكونات المجموعات إما في وسط مائي أو في صورة مجففة بالتجميد. عند استخدام الأجسام المضادة أو شظايا الارتباط بمولد الضد في المجموعات في شكل اتحادات يتم فيها إرفاق ملصق أو جزء علاجي ، مثل أيون معدني مشع أو جزء دوائي علاجي ، يمكن توفير مكونات مثل هذه الاتحادات إما في شكل مترافق بالكامل ، في شكل وسيطة أو كأجزاء منفصلة يتم تصريفها من قبل مستخدم المجموعة.

    في أحد جوانب الاختراع ، طريقة لتعديل نشاط إنزيمي واحد على الأقل من PSMA ، النشاط المختار من المجموعة التي تتكون من ثنائي ببتيداز حامضي مرتبط بـ N (NAALADase) ، هيدروليز الفولات ، ثنائي ببتيدل ثنائي ببتيداز IV وبيتا-جلوتاميل هيدرولاز نشاط أو توليفة منها في المختبر أو في الجسم الحي. قد يكون التعديل تعزيزًا أو تثبيطًا لنشاط إنزيمي واحد على الأقل لـ PSMA.

    في نموذج مفضل ، يوفر الاختراع طرقًا لتثبيط نشاط إنزيمي واحد على الأقل لـ PSMA ، والنشاط المختار من المجموعة التي تتكون من ثنائي ببتيداز حامضي مرتبط بـ N (NAALADase) ، وهيدرولاز الفولات ، وثنائي ببتيدل ثنائي ببتيداز IV وبيتا-جلوتاميل هيدرولاز نشاط أو توليفة منها في المختبر أو في الجسم الحي. تشتمل الطريقة على ملامسة NAALADase ، وهيدرولاز حمض الفوليك ، و dipeptidyl dipeptidase IV و / أو γ-glutamyl hydrolase مع كمية من الجسم المضاد المعزول أو جزء الارتباط بمولد الضد من الاختراع في ظل ظروف يكون فيها الجسم المضاد الوحيد النسيلة المعزول أو الارتباط بمولد الضد جزء منه يثبط نشاط NAALADase ، حمض الفوليك هيدرولاز ، dipeptidyl dipeptidase IV أو γ-glutamyl hydrolase.

    يمكن تحديد مستويات أنسجة NAALADase عن طريق إذابة الأنسجة المتجانسة في المنظفات ، وتكوير المادة غير القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي وقياس نشاط NAALADase في المادة الطافية المتبقية. وبالمثل ، يمكن أيضًا قياس نشاط NAALADase في سوائل الجسم عن طريق تكوير المادة الخلوية أولاً عن طريق الطرد المركزي وإجراء اختبار إنزيم نموذجي لنشاط NAALADase على المادة الطافية. تم وصف فحوصات إنزيم NAALADase بواسطة Frieden ، 1959 ، جي بيول ، كيم. ، 234: 2891. في هذا الاختبار ، يكون ناتج تفاعل إنزيم NAALADase هو حمض الجلوتاميك. هذا مشتق من الانقسام المحفز للإنزيم لـ N-acetylaspartylglutamate لإنتاج حمض N-acetylaspartic وحمض الجلوتاميك. ينتج حمض الجلوتاميك ، في NAD (P) + خطوة تتطلب 2-أوكسوجلوتارات بالإضافة إلى NAD (P) H في تفاعل محفز بواسطة نازعة هيدروجين الجلوتامات. يمكن قياس تقدم التفاعل بسهولة ويسر من خلال التغيير في الامتصاصية عند 340 نانومتر بسبب تحويل NAD (P) + إلى NAD (P) H.

    يمكن قياس نشاط هيدرولاز حمض الفوليك في PSMA عن طريق إجراء فحوصات الإنزيم كما وصفها Heston وآخرون (على سبيل المثال ، كلين. الدقة السرطان. 2(9):1445-51, 1996 جراحة المسالك البولية 49 (ملحق 3A): 104-12،1997). تزيل هيدرولازات الفولات مثل PSMA الغلوتامات المرتبطة بجاما من حمض الفوليك متعدد الجلوتامات. يمكن قياس نشاط هيدرولاز الفولات باستخدام ركائز مثل ميثوتريكسات ثلاثي جاما غلوتامات (MTXGlu3) وميثوتريكسات دي-جاما جلوتامات (MTXGlu2) وبتيرويل بنتاجلوتامات (PteGlu5) ، على سبيل المثال باستخدام الرحلان الكهربائي الشعري (انظر كلين. الدقة السرطان. 2 (9): 1445-51 ، 1996). الحضانات الموقوتة لـ PSMA مع ركائز متعددة الجلوتامات يتبعها فصل واكتشاف منتجات التحلل المائي.

    يتضمن الاختراع أيضًا أجسامًا مضادة معزولة وشظايا ربط منها تربط بشكل انتقائي مولدات PSMA. كما هو مستخدم في هذه الوثيقة ، خاصة فيما يتعلق بربط مولدات PSMA بواسطة الأجسام المضادة لـ PSMA وشظايا الربط ، تعني "الروابط الانتقائية" أن الجسم المضاد يرتبط بشكل تفضيلي بجهاز متعدد البروتين PSMA (على سبيل المثال ، مع شغف أكبر ، تقارب ارتباط أكبر) بدلاً من ذلك من مونومر بروتين PSMA. في تجسيدات مفضلة ، ترتبط الأجسام المضادة للاختراع متعدد المراتب البروتين PSMA مع شغف و / أو تقارب ربط 1.1 أضعاف ، 1.2 أضعاف ، 1.3 أضعاف ، 1.4 أضعاف ، 1.5 أضعاف ، 1.6 مرة ، 1.7 - أضعاف ، 1.8 أضعاف ، 1.9 أضعاف ، 2 أضعاف ، 3 أضعاف ، 4 أضعاف ، 5 أضعاف ، 7 أضعاف ، 10 أضعاف ، 20 ضعفًا ، 30 ضعفًا ، 40 ضعفًا ، 50 ضعفًا ، 70 ضعفًا ، 100 ضعفًا ، 200 ضعفًا ، 300 ضعفًا ، 500 ضعفًا ، 1000 ضعفًا أو أكثر من تلك التي أظهرها الجسم المضاد لمونومر بروتين PSMA. على نحو مفضل ، يرتبط الجسم المضاد بشكل انتقائي بجهاز متعدد الممرات لبروتين PSMA ، وليس مونومر بروتين PSMA ، أي يرتبط إلى حد كبير بجهاز متعدد الميمر بروتين PSMA. على نحو مفضل ، يرتبط الجسم المضاد انتقائيًا بثنائي بروتين PSMA.

    يمكن للجسم المضاد المعزول أو جزء الارتباط الذي يربط انتقائيًا ببروتين PSMA المتعدد ، في بعض النماذج ، أن يعدل النشاط الإنزيمي لبروتين PSMA المتعدد. في أحد هذه النماذج ، يثبط الجسم المضاد نشاط إنزيمي واحد على الأقل مثل نشاط NAALADase ، نشاط هيدرولاز الفولات ، نشاط dipeptidyl dipeptidase IV ، نشاط γ-glutamyl hydrolase ، أو توليفات منها. في نموذج آخر ، يعزز الجسم المضاد نشاط إنزيمي واحد على الأقل مثل نشاط NAALADase ، نشاط هيدرولاز الفولات ، نشاط dipeptidyl dipeptidase IV ، نشاط γ-glutamyl hydrolase ، أو توليفات منها.

    مُعدِّد بروتين PSMA ، كما هو مستخدم هنا ، عبارة عن مركب بروتيني مكون من بروتينين PSMA على الأقل أو شظايا منهما. يمكن أن تتكون مولدات بروتين PSMA من مجموعات مختلفة من بروتينات PSMA كاملة الطول (على سبيل المثال ، رقم تعريف التسلسل: 1) ، PSMA القابل للذوبان المؤتلف (rsPSMA ، على سبيل المثال ، الأحماض الأمينية 44-750 من رقم معرف التسلسل: 1) وشظايا من السابقة التي تشكل multimers (أي التي تحتفظ بمجال البروتين المطلوب لتشكيل ثنائيات و / أو أجهزة متعددة ذات رتبة أعلى من PSMA). في تجسيدات مفضلة ، يكون واحد على الأقل من بروتينات PSMA التي تشكل المولد المتعدد عبارة عن بولي ببتيد مؤتلف قابل للذوبان (rsPSMA). إن مولدات بروتين PSMA المفضل هي ثنائيات ، خاصة تلك المكونة من بروتين PSMA القابل للذوبان المؤتلف. التجسيد المفضل بشكل خاص هو rsPSMA homodimer.

    يُعتقد أن مولدات بروتين PSMA المشار إليها هنا تفترض تشكلاً أصليًا ويفضل أن يكون لها مثل هذا التشكل. ترتبط بروتينات PSMA في نماذج معينة ببعضها البعض بشكل غير تساهمي لتكوين مولّد بروتين PSMA. على سبيل المثال ، تم اكتشاف أن بروتين PSMA يرتبط بشكل غير تساهمي لتشكيل ثنائيات في ظل ظروف غير متغيرة الطبيعة ، كما هو موضح في الأمثلة أدناه.

    تستطيع مولدات بروتين PSMA ، ويفضل أن تفعل ، الاحتفاظ بأنشطة PSMA. قد يكون نشاط PSMA نشاطًا إنزيميًا ، مثل نشاط حمض الفوليك هيدرولاز ونشاط NAALADase ونشاط ثنائي ببتيدل ببتيداز IV ونشاط بيتا جلوتاميل هيدرولاز. طرق اختبار نشاط PSMA لأجهزة المالتيميتر معروفة جيدًا في المجال (راجعها O'Keefe et al. في: سرطان البروستاتا: علم الأحياء وعلم الوراثة والعلاجات الجديدة، L.W K. Chung ، W.B. Isaacs and J.W Simons (eds.) Humana Press، Totowa، NJ، 2000، pp. 307-326) ، وبعضها موصوف في الأمثلة أدناه.

    في جوانب معينة ، يشتمل الاختراع أيضًا على تركيبات تشتمل على واحد أو أكثر من مولدات بروتين PSMA المعزولة الموصوفة هنا ، مثل ثنائيات بروتين PSMA. في تجسيدات مفضلة ، تحتوي التركيبة متعددة المفاعلات لبروتين PSMA على الأقل على حوالي 10٪ من مولدات بروتين PSMA. في نماذج أخرى ، تحتوي تركيبة البروتين المتعدد PSMA على الأقل على حوالي 20٪ ، 30٪ ، 40٪ ، 50٪ ، 60٪ ، 70٪ ، 75٪ ، 80٪ ، 85٪ ، 90٪ ، 95٪ ، 99٪ أو 99.5 ٪ بروتين PSMA متعدد. في تجسيد مفضل ، تحتوي التركيبة المتعددة لبروتين PSMA على مولدات بروتين PSMA نقي إلى حد كبير ، مع عدم وجود مونومر بروتين PSMA فعليًا. من المفهوم أن قائمة النسب المئوية المحددة تتضمن عن طريق الاستدلال جميع النسب المئوية غير المسماة بين النسب المئوية المقروءة.

    كما هو مستخدم هنا فيما يتعلق بالعديد الببتيدات أو البروتينات أو شظايا منها ، تعني كلمة "معزولة" منفصلة عن بيئتها الأصلية وموجودة بكمية كافية للسماح بتعريفها أو استخدامها. المعزولة ، عند الإشارة إلى بروتين أو عديد ببتيد ، تعني ، على سبيل المثال: (1) يتم إنتاجه بشكل انتقائي عن طريق استنساخ التعبير أو (2) تنقيته بواسطة كروماتوجرافيا أو رحلان كهربائي. قد تكون البروتينات أو البولي ببتيدات المعزولة نقية إلى حد كبير ، ولكن ليس من الضروري أن تكون. يعني المصطلح "نقي بشكل جوهري" أن البروتينات أو عديد الببتيدات خالية بشكل أساسي من المواد الأخرى التي يمكن أن توجد بها في الطبيعة أو في أنظمة الجسم الحي إلى حد عملي ومناسب للاستخدام المقصود. يمكن إنتاج عديد ببتيدات نقية بدرجة كبيرة بواسطة تقنيات معروفة جيدًا في المجال. نظرًا لأنه يمكن خلط بروتين معزول مع مادة حاملة مقبولة صيدلانيًا في مستحضر صيدلاني ، يمكن أن يشتمل البروتين على نسبة مئوية صغيرة بالوزن من المستحضر. ومع ذلك ، يتم عزل البروتين لأنه قد تم فصله عن المواد التي قد يرتبط بها في الأنظمة الحية ، أي معزول عن البروتينات الأخرى.

    يُفضل أن تكون أجزاء بروتين PSMA هي تلك الأجزاء التي تحتفظ بقدرة وظيفية مميزة لبروتين PSMA. تتضمن القدرات الوظيفية التي يمكن الاحتفاظ بها في جزء ارتباط جزيئات PSMA الأخرى لتكوين ثنائيات ومعدلات ذات رتبة أعلى ، والتفاعل مع الأجسام المضادة ، والتفاعل مع عديد الببتيدات الأخرى أو أجزاء منها ، والنشاط الإنزيمي. يمكن اختيار شظايا بروتين PSMA الأخرى ، على سبيل المثال ، الأجزاء الأخرى القابلة للذوبان المؤتلفة من رقم تعريف التسلسل: 1 ، وفقًا لخصائصها الوظيفية. على سبيل المثال ، يمكن لأحد أصحاب المهارة العادية في المجال تحضير أجزاء PSMA بشكل متجانس واختبار تلك الأجزاء وفقًا للطرق الموضحة أدناه.

    عادةً ما يتم إجراء تعديلات على عديد ببتيد PSMA على الحمض النووي الذي يشفر عديد ببتيد PSMA ، ويمكن أن يشمل الحذف ، والطفرات النقطية ، والاقتطاع ، واستبدالات الأحماض الأمينية وإضافات الأحماض الأمينية أو شقوق الأحماض غير الأمينية. بدلاً من ذلك ، يمكن إجراء تعديلات مباشرة على البولي ببتيد ، على سبيل المثال عن طريق الانقسام ، إضافة جزيء رابط ، إضافة جزء يمكن اكتشافه ، مثل البيوتين ، إضافة حمض دهني ، وما شابه. تشمل التعديلات أيضًا بروتينات الاندماج التي تشتمل على كل أو جزء من تسلسل الأحماض الأمينية PSMA.

    بشكل عام ، تشتمل عديد الببتيدات PSMA المعدلة على عديد ببتيدات تم تعديلها خصيصًا لتغيير سمة من عديد الببتيد لا علاقة لها بنشاطها الفسيولوجي. على سبيل المثال ، يمكن استبدال بقايا السيستين أو حذفها لمنع روابط ثاني كبريتيد غير المرغوب فيها. وبالمثل ، يمكن تغيير بعض الأحماض الأمينية لتعزيز التعبير عن بولي ببتيد PSMA عن طريق القضاء على التحلل البروتيني بواسطة البروتياز في نظام التعبير (على سبيل المثال ، بقايا الأحماض الأمينية ثنائية القاعدة في أنظمة تعبير الخميرة التي يوجد فيها نشاط إنزيم البروتين KEX2).

    يتم تحضير التعديلات بشكل ملائم عن طريق تغيير جزيء الحمض النووي الذي يشفر بولي ببتيد PSMA.يُفضل أن تحافظ طفرات الحمض النووي الذي يشفر بولي ببتيد PSMA على إطار قراءة الأحماض الأمينية لتسلسل الترميز ، ويفضل ألا تخلق مناطق في الحمض النووي من المحتمل أن تتهجين لتشكيل هياكل ثانوية ، مثل دبابيس الشعر أو الحلقات ، والتي يمكن تكون ضارة للتعبير عن عديد الببتيد المعدل.

    يمكن إجراء التعديلات عن طريق اختيار بديل للحمض الأميني ، أو عن طريق الطفرات العشوائية لموقع محدد في الحمض النووي الذي يشفر بولي ببتيد PSMA. يمكن بعد ذلك التعبير عن عديد ببتيدات PSMA المعدلة واختبارها لواحد أو أكثر من الأنشطة (على سبيل المثال ، ارتباط الجسم المضاد ، النشاط الأنزيمي ، الاستقرار متعدد الوحدات) لتحديد الطفرة التي توفر بولي ببتيد معدل مع الخصائص المرغوبة. يمكن إجراء المزيد من الطفرات على polypeptides PSMA المعدلة (أو إلى polypeptides PSMA غير المعدلة) والتي تكون صامتة فيما يتعلق بتسلسل الأحماض الأمينية للبولي ببتيد ، ولكنها توفر أكواد مفضلة للترجمة في مضيف معين. الكودونات المفضلة لترجمة الحمض النووي في ، على سبيل المثال ، بكتريا قولونية، معروفين جيدًا لأولئك الذين يتمتعون بالمهارة العادية في الفن. لا يزال من الممكن إجراء طفرات أخرى للتسلسلات غير المشفرة لتسلسل تشفير PSMA أو استنساخ cDNA لتعزيز التعبير عن عديد الببتيد. يمكن اختبار نشاط عديد الببتيدات PSMA المعدلة عن طريق استنساخ الجين الذي يشفر بولي ببتيد PSMA المعدل في ناقل تعبير بكتيري أو ثديي ، وإدخال المتجه في خلية مضيفة مناسبة ، والتعبير عن بولي ببتيد PSMA المعدل ، واختبار القدرة الوظيفية لـ PSMA عديد الببتيدات على النحو الذي تم الكشف عنه هنا. الإجراءات السابقة معروفة جيدًا لمن يتمتع بمهارة عادية في الفن.

    سيدرك الحرفي الماهر أيضًا أن بدائل الأحماض الأمينية المحافظة يمكن إجراؤها في بولي ببتيدات PSMA لتوفير عديد ببتيدات PSMA مكافئ وظيفيًا ، أي عديد ببتيدات PSMA المعدلة التي تحتفظ بالقدرات الوظيفية لعديد ببتيدات PSMA. كما هو مستخدم هنا ، يشير "استبدال الأحماض الأمينية المحافظة" إلى استبدال الحمض الأميني الذي لا يغير الشحنة النسبية أو خصائص الحجم للبروتين الذي يتم فيه استبدال الأحماض الأمينية. يمكن تحضير عديد ببتيدات PSMA المعدلة وفقًا لطرق تغيير تسلسل عديد الببتيد المعروف لمهارة عادية في الفن مثل الموجودة في المراجع التي تجمع مثل هذه الطرق ، على سبيل المثال الاستنساخ الجزيئي: دليل معمل، J. Sambrook، et al.، eds.، Second Edition، Cold Spring Harbour Laboratory Press، Cold Spring Harbour، NY، 1989، or البروتوكولات الحالية في علم الأحياء الجزيئي، F.M Ausubel ، et al.، eds.، John Wiley & Sons، Inc.، New York. تشتمل عديد الببتيدات PSMA المكافئة وظيفيًا على بدائل الأحماض الأمينية المحافظة من رقم معرف التسلسل: 1 ، أو أجزاء منها ، مثل بولي ببتيد PSMA القابل للذوبان المؤتلف (الأحماض الأمينية 44-750 من رقم معرف التسلسل: 1). تشمل البدائل المحافظة للأحماض الأمينية بدائل تم إجراؤها بين الأحماض الأمينية ضمن المجموعات التالية: (أ) M ، I ، L ، V (b) F ، Y ، W (c) K ، R ، H (d) A ، G (e) ) S، T (f) Q، N and (g) E، D.

    عادة ما يتم إجراء بدائل الأحماض الأمينية المحافظة في عديد الببتيدات PSMA عن طريق تغيير الحمض النووي الذي يشفر بولي ببتيد PSMA. يمكن إجراء مثل هذه الاستبدالات من خلال مجموعة متنوعة من الطرق المعروفة لذوي المهارة العادية في المجال. على سبيل المثال ، يمكن إجراء استبدالات الأحماض الأمينية بواسطة طفرة موجهة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، أو طفرات موجهة بالموقع ، أو عن طريق التخليق الكيميائي للجين الذي يشفر بولي ببتيد PSMA. عندما يتم إجراء بدائل للأحماض الأمينية لجزء صغير من بولي ببتيد PSMA ، يمكن إجراء الاستبدالات عن طريق تخليق الببتيد مباشرة. يمكن اختبار نشاط الأجزاء المكافئة وظيفيًا لعديد ببتيدات PSMA عن طريق استنساخ الجين الذي يشفر بولي ببتيد PSMA المتغير في ناقل تعبير بكتيري أو ثديي ، وإدخال المتجه في خلية مضيفة مناسبة ، والتعبير عن بولي ببتيد PSMA المتغير ، واختبار القدرة الوظيفية من عديد الببتيدات PSMA كما هو موضح هنا.

    مولدات بروتين PSMA كما هو موصوف هنا لها عدد من الاستخدامات ، بعضها موصوف في مكان آخر هنا. تعد الوحدات المتعددة مفيدة لاختبار المركبات التي تعدل النشاط الأنزيمي PSMA أو تعدد PSMA. يمكن استخدام المضاعفات المتعددة لعزل الأجسام المضادة التي تربط PSMA بشكل انتقائي ، بما في ذلك تلك الانتقائية للحلقات التوافقية ، وتلك الانتقائية لربط PSMA متعدد المرات وليس مونومرات PSMA ، وتلك التي تعدل بشكل انتقائي النشاط الأنزيمي لـ PSMA. يمكن أيضًا استخدام المضاعفات المتعددة ، وخاصة PSMA الخافت ، لتحفيز أو زيادة الاستجابات المناعية لـ PSMA ، كتركيبات لقاح.

    تشمل العوامل التي تعدل بشكل انتقائي نشاطًا إنزيميًا لـ PSMA عوامل تثبط أو تعزز نشاط إنزيمي واحد على الأقل لـ PSMA ، مثل نشاط NAALADase ، نشاط حمض الفوليك ، نشاط dipeptidyl dipeptidase IV ، نشاط γ-glutamyl hydrolase ، أو توليفات منها.

    وبالتالي ، يتم توفير طرق الغربلة للعوامل المرشحة التي تعدل نشاطًا إنزيميًا واحدًا على الأقل لأنزيم PSMA وفقًا للاختراع. يمكن أن تتضمن الطرق خلط العامل المرشح مع مولّد بروتين PSMA معزول لتكوين خليط تفاعل ، وبالتالي الاتصال بإنزيم PSMA مع العامل المرشح. تتضمن الطرق أيضًا إضافة ركيزة لإنزيم PSMA إلى خليط التفاعل ، وتحديد كمية المنتج المتكون من الركيزة بواسطة إنزيم PSMA. هذه الطرق قابلة للتكيف مع الفرز الآلي عالي الإنتاجية للمركبات. يشير الانخفاض في كمية المنتج المتكون بالمقارنة مع عنصر التحكم إلى وجود عامل قادر على تثبيط نشاط إنزيمي واحد على الأقل من إنزيم PSMA. تشير الزيادة في كمية المنتج المتكون بالمقارنة مع عنصر تحكم إلى وجود عامل قادر على تعزيز نشاط إنزيمي واحد على الأقل من إنزيم PSMA. يمكن أن يكون إنزيم PSMA هو NAALADase ، حمض الفوليك هيدرولاز ، dipeptidyl dipeptidase IV و / أو γ-glutamyl hydrolase. يُفضل أن يكون إنزيم PSMA عبارة عن جهاز PSMA متعدد المراتب يشتمل على PSMA قابل للذوبان في المؤتلف ، ويفضل أن يكون ثنائيًا غير مرتبط بشكل غير تساهمي لـ PSMA في التشكل الأصلي.

    يشتمل خليط التفاعل على عامل مرشح. يُفضل أن يكون العامل المرشح جسمًا مضادًا ، أو مركبًا عضويًا صغيرًا ، أو ببتيدًا ، وبالتالي يمكن اختياره من مكتبات الأجسام المضادة التوافقية ، أو مكتبات البروتين التوافقية ، أو مكتبات الجزيئات العضوية الصغيرة. عادة ، يتم تشغيل مجموعة من مخاليط التفاعل بالتوازي مع تركيزات مختلفة من العوامل للحصول على استجابة مختلفة للتركيزات المختلفة. نموذجياً ، يعمل أحد هذه التركيزات كعنصر تحكم سلبي ، أي عند تركيز صفري للعامل أو عند تركيز عامل أقل من حدود الكشف عن المقايسة.

    تشمل العوامل المرشحة العديد من الفئات الكيميائية ، على الرغم من أنها عادةً مركبات عضوية أو بروتينات أو أجسام مضادة (وشظايا منها تربط المستضد). في بعض النماذج المفضلة ، تكون العوامل المرشحة عبارة عن مركبات عضوية صغيرة ، أي تلك التي لها وزن جزيئي يزيد عن 50 ولكن أقل من حوالي 2500 ، ويفضل أقل من حوالي 1000 ، ويفضل أكثر ، أقل من حوالي 500. تشتمل العوامل المرشحة على مادة كيميائية وظيفية مجموعات ضرورية للتفاعلات الهيكلية مع عديد ببتيدات و / أو أحماض نووية ، وتشتمل نموذجيًا على الأقل على مجموعة أمين ، أو كربونيل ، أو هيدروكسيل ، أو كربوكسيل ، ويفضل مجموعتان على الأقل من المجموعات الكيميائية الوظيفية ويفضل أكثر على الأقل ثلاث مجموعات كيميائية وظيفية. يمكن أن تشتمل العوامل المرشحة على كربون دوري أو بنية حلقية غير متجانسة و / أو هياكل عطرية أو متعددة العطرية يتم استبدالها بواحدة أو أكثر من المجموعات الوظيفية المحددة أعلاه. يمكن أن تكون العوامل المرشحة أيضًا جزيئات حيوية مثل الببتيدات والسكريات والأحماض الدهنية والستيرولات والأيزوبرينويدات والبيورينات والبيريميدينات والمشتقات أو النظائر الهيكلية لما سبق ، أو مجموعات منها وما شابه ذلك.

    يتم الحصول على العوامل المرشحة من مجموعة متنوعة من المصادر بما في ذلك مكتبات المركبات الاصطناعية أو الطبيعية. على سبيل المثال ، تتوفر العديد من الوسائل للتوليف العشوائي والموجه لمجموعة واسعة من المركبات العضوية والجزيئات الحيوية ، بما في ذلك التعبير عن أوليغنوكليوتيدات العشوائية ، والمكتبات التجميعية العضوية التركيبية ، ومكتبات عرض العاثيات من الببتيدات العشوائية أو غير العشوائية ، والمكتبات التوافقية للبروتينات أو الأجسام المضادة ، وما شابه ذلك. بدلاً من ذلك ، تتوفر مكتبات من المركبات الطبيعية في شكل مستخلصات بكتيرية وفطرية ونباتية وحيوانية أو يتم إنتاجها بسهولة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل المكتبات والمركبات الطبيعية والصناعية بسهولة من خلال الوسائل الكيميائية والفيزيائية والكيميائية الحيوية التقليدية. علاوة على ذلك ، قد تخضع العوامل المعروفة لتعديلات كيميائية موجهة أو عشوائية مثل الأسيلة ، والألكلة ، والأسترة ، والتوسط ، وما إلى ذلك لإنتاج نظائر هيكلية للعوامل.

    يمكن أيضًا تضمين مجموعة متنوعة من الكواشف الأخرى في الخليط. وتشمل هذه الكواشف مثل الأملاح ، والمخازن المؤقتة ، والبروتينات المحايدة (مثل الألبومين) ، والمنظفات ، وما إلى ذلك والتي يمكن استخدامها لتسهيل الارتباط الأمثل بالبروتين و / أو عامل البروتين. قد يقلل هذا الكاشف أيضًا التفاعلات غير المحددة أو الخلفية لمكونات التفاعل. يمكن أيضًا استخدام الكواشف الأخرى التي تعمل على تحسين كفاءة الفحص مثل مثبطات الأنزيم البروتيني ومثبطات نوكلياز والعوامل المضادة للميكروبات وما شابه.

    يتم تحضين خليط مواد التفاعل السابقة في ظروف حيث يتفاعل العامل المرشح مع إنزيم PSMA. يمكن بسهولة تحديد ترتيب إضافة المكونات ودرجة حرارة الحضانة ووقت الحضانة والمعلمات الأخرى للمقايسة. يتضمن هذا التجريب فقط تحسين معلمات الفحص ، وليس التكوين الأساسي للمقايسة. عادة ما تكون درجات حرارة الحضانة بين 4 درجات مئوية و 40 درجة مئوية. يفضل تقليل أوقات الحضانة لتسهيل الفرز السريع عالي الإنتاجية ، وعادة ما تكون بين 0.1 و 10 ساعات.

    بعد فترة الحضانة ، يتم الكشف عن وجود أو عدم وجود نشاط إنزيم PSMA بأي طريقة ملائمة متاحة للمستخدم. على سبيل المثال ، يمكن أن يحتوي خليط التفاعل على ركيزة لإنزيم PSMA. يفضل أن تكون الركيزة و / أو المنتج المتكون من عمل إنزيم PSMA قابلاً للاكتشاف. تشتمل الركيزة عادةً على ملصق يمكن اكتشافه أو تقترن به. يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الملصقات ، مثل تلك التي توفر الكشف المباشر (على سبيل المثال ، النشاط الإشعاعي ، التألق ، البصري ، أو كثافة الإلكترون ، إلخ) أو الكشف غير المباشر (على سبيل المثال ، علامة الحاتمة مثل FLAG epitope ، علامة الإنزيم مثل الفجل بيروكسيداز ، إلخ). قد يكون الملصق مرتبطًا بالركيزة ، أو مدمجًا في بنية الركيزة.

    يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الطرق لاكتشاف الملصق ، اعتمادًا على طبيعة الملصق ومكونات الفحص الأخرى. على سبيل المثال ، قد يتم الكشف عن الملصق أثناء ربطه بالركيزة أو بعد الانفصال عن الركيزة. يمكن الكشف عن الملصقات بشكل مباشر من خلال الكثافة الضوئية أو كثافة الإلكترون ، والانبعاثات المشعة ، ونقل الطاقة غير الإشعاعية ، وما إلى ذلك ، أو اكتشافها بشكل غير مباشر باستخدام اتحادات الأجسام المضادة ، وتقارن ستريبافيدين-بيوتين ، وما إلى ذلك. طرق الكشف عن مجموعة متنوعة من الملصقات معروفة جيدًا في المجال.


    وصف موجز للجداول

    [0057] يلخص الجدول 1 التسميات لمتواليات عديد النوكليوتيد وعديد الببتيد كامل الطول للاختراع الحالي.

    [0058] يوضح الجدول 2 رقم تعريف بنك الجينات والتعليق التوضيحي لأقرب متماثل لبنك الجينات لعديد الببتيدات الخاصة بالاختراع. تظهر أيضًا درجة الاحتمالية للمطابقة بين كل عديد ببتيد ومماثل GenBank الخاص به.

    [0059] يوضح الجدول 3 السمات الهيكلية لتسلسلات البولي ببتيد للاختراع ، بما في ذلك الأشكال والمجالات المتوقعة ، جنبًا إلى جنب مع الطرق والخوارزميات وقواعد البيانات القابلة للبحث المستخدمة لتحليل البولي ببتيدات.

    [0060] يسرد الجدول 4 أجزاء cDNA و / أو DNA الجينومية التي تم استخدامها لتجميع متواليات عديد النوكليوتيد للاختراع ، جنبًا إلى جنب مع أجزاء مختارة من متواليات عديد النوكليوتيد.

    [0061] يوضح الجدول 5 مكتبة cDNA التمثيلية لعديد النوكليوتيدات للاختراع.

    [0062] يوفر الجدول 6 ملحقًا يصف الأنسجة والنواقل المستخدمة لبناء مكتبات (كدنا) الموضحة في الجدول 5.

    [0063] يوضح الجدول 7 الأدوات والبرامج والخوارزميات المستخدمة لتحليل عديد النيوكليوتيدات وعديد الببتيدات الخاصة بالاختراع ، جنبًا إلى جنب مع الأوصاف والمراجع والمعلمات الأولية القابلة للتطبيق.


    1.8: تنقية الحمض النووي الريبي لمستشعر السموم المتحولة ykkCD وتقييم نقاوته باستخدام تغيير طبيعة الصفحة وطيف الأشعة فوق البنفسجية - علم الأحياء

    تعرف على ما تفعله منظمة الأغذية والزراعة فيما يتعلق بالوباء الحالي وتأثيراته على الأغذية والزراعة. تحقق من برنامج الفاو للاستجابة والتعافي من مرض كوفيد -19.

    تحسين الوقاية من الأمراض الحيوانية المنشأ والإنتاج الحيواني من خلال التقنيات المشتقة من الأسلحة النووية

    افتتحت منظمة الأغذية والزراعة والوكالة الدولية للطاقة الذرية الندوة الدولية حول الإنتاج الحيواني المستدام وصحة الحيوان

    من المؤتمر الحادي والأربعين إلى الثاني والأربعين: برزت منظمة فاو ديناميكية جديدة

    نظرة إلى الفاو على مدى العامين الماضيين

    يرصد تقرير منظمة الأغذية والزراعة رؤى من النظم الغذائية للشعوب الأصلية والتهديدات التي تتعرض لها

    تبحث الدراسة التعاونية في ثمانية أنظمة غذائية للشعوب الأصلية في الأمازون والساحل والهيمالايا وجزر المحيط الهادئ والقطب الشمالي ، وتوثق القدرة الفريدة على الحفاظ على التنوع البيولوجي وتعزيز الأمن الغذائي المرن وتدعو إلى الاعتراف بحقوق الأراضي والممارسات التقليدية


    1.8: تنقية الحمض النووي الريبي لمستشعر السموم المتحولة ykkCD وتقييم نقاوته باستخدام تغيير طبيعة الصفحة وطيف الأشعة فوق البنفسجية - علم الأحياء

    تعرف على ما تفعله منظمة الأغذية والزراعة فيما يتعلق بالوباء الحالي وتأثيراته على الأغذية والزراعة. اطلع على برنامج الفاو للاستجابة والتعافي من مرض كوفيد -19.

    تحسين الوقاية من الأمراض الحيوانية المنشأ والإنتاج الحيواني من خلال التقنيات المشتقة من الأسلحة النووية

    افتتحت منظمة الأغذية والزراعة والوكالة الدولية للطاقة الذرية الندوة الدولية حول الإنتاج الحيواني المستدام وصحة الحيوان

    من المؤتمر الحادي والأربعين إلى الثاني والأربعين: برزت منظمة فاو ديناميكية جديدة

    نظرة إلى الفاو على مدى العامين الماضيين

    تقرير منظمة الأغذية والزراعة يرسم رؤى من النظم الغذائية للشعوب الأصلية والتهديدات التي تتعرض لها

    تبحث الدراسة التعاونية في ثمانية أنظمة غذائية للشعوب الأصلية في الأمازون والساحل والهيمالايا وجزر المحيط الهادئ والقطب الشمالي ، وتوثق القدرة الفريدة على الحفاظ على التنوع البيولوجي وتعزيز الأمن الغذائي المرن وتدعو إلى الاعتراف بحقوق الأراضي والممارسات التقليدية


    شاهد الفيديو: علم الأحياء تحت المجهر: ما الحمض النووي والحمض النووي الريبي (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Tapani

    أيضا أننا سنفعل بدون عبارة ممتازة



اكتب رسالة