معلومة

تصميم الاشعال لـ PCR من تسلسل الحمض النووي المعطى

تصميم الاشعال لـ PCR من تسلسل الحمض النووي المعطى


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

بالنظر إلى التسلسل: 5'-ACTGACTATGTAGAA ... GGCCCTAAGGGCCAA-3 '(1)

تريد أن تفعل PCR لهذا dsDNA لإضافة "overhangs" في نهاياته. في نهاية 5 'ستضع موقع تقييد إنزيم NdeI (5'-CATATG). في النهاية 3 ، ستضع موقع التقييد لـ MspI (5'-CCGG).

اكتب متواليات الاشعال "الأمامي" و "العكسي" للقيام بذلك. يجب أن تكون كل مادة أولية 16-18 nt ، مع 12 nt للتهجين و4-6 nt لـ "overhang".

أنا مرتبك قليلاً فيما يتعلق بكيفية كتابة التمهيديين الأمامي والخلفي للتسلسل. لقد رأيت من مقاطع الفيديو أنه يجب أن أكتب الخيط التكميلي لخيط العطاء الخاص بي. التي من شأنها أن تكون:

3 '-TGACTGATACATCTT ... CCGGATTCCCGGTT-5' (2)

ثم من التسلسل (1) يجب أن أحصل على التمهيدي العكسي ومن التسلسل (2) التمهيدي الأمامي. ومع ذلك ، هذا لا يسمح لي بإضافة كل من إنزيمات التقييد لأن كلا البادئين سيكونان من 5 'إلى 3'.

أم هل يجب أن آخذ التسلسل المعطى وأكتب البادئات فقط من ذلك؟ بحيث تكون البادئات:

التمهيدي إلى الأمام: 3'-GGCCتجاكتجاتاكات

التمهيدي العكسي: GGATTCCCGGTTGTATAC - 5'

حيث nts الغامقة هي مواقع التقييد.

شكرا لك!


كما هو مذكور في التعليقات أعلاه ، تذكر أنك تقوم بتضخيم الحمض النووي المزدوج الشريطة ، لذلك يجب إنشاء خيطين عكسيين جديدين من كل دورة (حتى يمكن تهجينهما مع بعضهما البعض). كما هو مكتوب في إجابتك ، سيتم تهجين كل من البادئات الخاصة بك مع خيطك المحدد ، ولن تتداخل الأمبليكون (رابط واحد في كل طرف ، ولكن كلاهما سيتضخم في نفس الاتجاه).

لإصلاح هذا الأمر ، أنت بحاجة إلى أساس واحد يرتبط بالتسلسل المستهدف ، وآخر يرتبط بالخيط التكميلي العكسي ، الذي قمت بإنشائه بالفعل. يمتد amplicons الجديد 5 '-> 3' (من 3 'نهاية التمهيدي ليس النموذج) ، لذلك تحتاج البرايمر إلى الارتباط عند الطرف 3 من خصلة كل منها. هذا الرابط لديه تصور جيد لذلك.

3 'نهاية التمهيدي يحتاج إلى التهجين بإحكام مع القالب ، لأن هذا هو المكان الذي يحدث فيه الامتداد (تمت مناقشته في هذا الدليل). لذا فإن تسلسلات موقع التقييد المرافقة ستكون دائمًا في نهاية 5 'لأي من التمهيديين (لاحظ أن السؤال يلمح في الواقع إلى هذا من خلال الإشارة إلى نهاية 5' لكل جانب).

التمهيدي المقدم على أنه التمهيدي "العكسي" سيرتبط فعليًا بالنهاية 3 من التسلسل المحدد في الاتجاه المناسب ، ولكن قد ترغب في وضع 3 'الخاص بك على الطرف 5' من هذا التسلسل التمهيدي ، لأن هذا سيكون من الناحية النظرية ، يكون الطرف 3 من amplicon الخاص بك. سيحتاج جهاز التمهيدي الآخر إلى ربط الطرف 3 من المكمل العكسي (وهو نهاية 5 بوصات لهدفك) ، لذلك سيكون له جانب موقع التقييد 5 بوصات.

حسب الاصطلاح ، يتم دائمًا تقديم تسلسلات التمهيدي بتنسيق 5 '- 3'. لذا تأكد من أن إجابتك تتبع هذا العرف. (أي 5'-الجناح-الرئيسية -3 ').

إذا كان كل هذا يبدو محيرًا حقًا ، فهذا لأنه كذلك. أفعل هذا من أجل لقمة العيش ، وما زلت دائمًا أتحقق من البرايمر في برنامج مثل Primer3


كيفية تصميم مواد أولية للطفرات الموجهة من الموقع

الطفرات الموجهة بالموقع (SDM) هي في المختبر طريقة لخلق طفرة في تسلسل معروف. غالبًا ما يتم إجراؤه بواسطة الطرق القائمة على PCR. عادة ، يتم تغيير قاعدة أو قاعدتين في الطفرات الموجهة بالموقع. يمكن تصميم الاشعال بالطفرات المرغوبة لإدخال تغييرات صغيرة على تسلسل النوكليوتيدات. يمكن استخدام امتداد التمهيدي و PCR العكسي لإدخال طفرات واسعة النطاق. قد يغير هذا النهج تكوين الأحماض الأمينية لبروتين معين. يتم استخدام الطفرات الموجهة بالموقع لدراسة التغيرات في نشاط البروتينات. كما أنها تستخدم في صنع بروتينات الاندماج أيضًا.

المجالات الرئيسية التي تمت تغطيتها

المصطلحات الأساسية: عمليات الحذف ، الإدراج ، الطفرات ، الطفرات الموجهة من الموقع ، البدائل ، تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي


تصميم تمهيدي خاص بالعائلة: أداة لتصميم Oligonucleotides المنحل بتوافق الآراء

قد يكون تصميم بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل المتحللة لقوالب تسلسل نيوكليوتيد غير معروف مهمة صعبة للغاية. في هذا البحث ، نقدم طريقة جديدة لتصميم البادئات المتدهورة ، المنفذة في برامج الكمبيوتر ذات التصميم التمهيدي المتدهور (FAS-DPD) الخاص بالعائلة ، والتي تكون نقطة البداية لها محاذاة متعددة للأحماض الأمينية ذات الصلة أو تسلسل النيوكليوتيدات. لتقييم كفاءتها ، تم استخدام أربع مجموعات مختلفة من الجينوم ، تغطي مجموعة واسعة من الأطوال الجينومية: أرينا (

& # 13 نيوكليوتيدات) ، باكولوفيروس (

بي بي) ، اكتوباكيللوس ص. (

bp) و الزائفة ص. (& # 13 إلى

بي بي). في كل حالة ، تم اختبار الاشعال المصممة FAS-DPD حسابيا لقياس الخصوصية. البرايمر المصممة لـ أرينا و باكولوفيروس تم اختبارها تجريبيا. الطريقة المقدمة هنا مفيدة لتصميم بادئات متدهورة على مجموعات من متواليات البروتين ذات الصلة ، مما يسمح باكتشاف أفراد الأسرة الجدد.

1 المقدمة

يسمح تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) ، وهو أحد أهم أدوات التحليل في البيولوجيا الجزيئية ، بالكشف عالي الحساسية والتنميط الجيني المحدد للعينات البيئية ، وهو أمر مهم بشكل خاص في العصر الميتاجينومي [1]. تتضمن قائمة كبيرة من تطبيقات تصنيف الجينوم PCR معدة بشكل تعسفي [2] (AP-PCR) ، وحمض نووي مضخم عشوائي تم تحضيره [3] (RAPD) ، وتعدد أشكال طول جزء تقييد PCR [4] (PCR-RFLP) ، وتضخيم مباشر للطول تعدد الأشكال [5] (DALP). تتطلب كل هذه التقنيات جودة عالية ونقاء للقالب المستهدف المحدد ، لأن أي DNA متاح يمكن أن يكون ركيزة لخطوة التضخيم. في ضوء ذلك ، تكون إجراءات التنميط الجيني للجينومات الكبيرة أو العينات المعقدة أكثر موثوقية إذا كانت تستند إلى تضخيم الحمض النووي باستخدام قليلات النوكليوتيدات المحددة. لذلك ، يعد التصميم التمهيدي أمرًا حاسمًا للتضخيم الفعال والناجح.

تتوفر العديد من برامج التصميم التمهيدي (على سبيل المثال ، OLIGO [6] ، OSP [7 ، 8] ، Primer Master [9] ، PRIDE [10] ، Primer3 [11] ، من بين أمور أخرى). بغض النظر عن كل استراتيجية عمل حسابية ، كل هذه تستخدم مجموعة من المعايير المشتركة (على سبيل المثال ،

المحتوى ، ودرجة حرارة الانصهار ، وما إلى ذلك) لتقييم جودة المرشحين التمهيدي في منطقة مستهدفة محددة من قبل المستخدم. تهدف البرامج البديلة إلى أغراض أكثر تحديدًا ، مثل اختيار البادئات التي ترتبط بالمناطق الجينومية المحفوظة بناءً على محاذاة التسلسل المتعدد [12 ، 13] ، التصميم التمهيدي للتضخيم الانتقائي لمناطق ترميز البروتين [14] ، تصميم قليل النوكليوتيد للموقع- موجه الطفرات [15] ، وتصميم التمهيدي للتهجين [16]. عادة ، يتطلب تصميم بادئات محددة حقًا معلومات عن تسلسل النوكليوتيدات الكامل. هذه هي نقطة البداية لمعظم البرامج الموصوفة في الأدبيات. ومع ذلك ، فإن الحاجة إلى تصميم بادئات محددة لا تكون دائمًا مصحوبة بالمعرفة الكاملة لتسلسل الجينوم المستهدف.

يسمى التمهيدي ، أو بشكل عام أي تسلسل DNA ، محددًا إذا كان يمثل تسلسلًا فريدًا ويسمى متدهورًا إذا كان يمثل مجموعة من التسلسلات الفريدة. على سبيل المثال ، يمكن ترميز تسلسل الأحماض الأمينية "YHP" بواسطة "TATCATCCC" أو "TACCATCCA" أو "TACCACCCG" ، من بين أمور أخرى ، كل هذه متواليات فريدة يمكن تلخيصها في تسلسل نيوكليوتيد "متحلل" "TAYCARCCN ،" باستخدام كود IUPAC. من الناحية العملية ، يشير استخدام التمهيدي المتحلل إلى استخدام مجموعة من البادئات المحددة التي تغطي جميع التركيبات الممكنة لتسلسل النوكليوتيدات المشفرة لتسلسل بروتين معين. أيضا ، يمكن استخدام الاشعال بما في ذلك القواعد المعدلة. يمكن أن تتطابق بعض القواعد المعدلة مع قواعد مختلفة.

على الرغم من أن الزيادة في الانحطاط تزيد من فرصة التلدين غير المحدد للبادئات المصممة ، إلا أنها تزيد أيضًا من احتمال العثور على متغيرات متباينة غير معروفة لعائلة متسلسلة. يجب أن يؤخذ هذا السلوك المزدوج في الاعتبار أثناء التصميم. عادةً ما يُعرَّف البحث الخوارزمي عن البادئات التي تتضمن مواضع متدهورة على أنها مشكلة تصميم التمهيدي المتدهور (DPD). في السنوات الأخيرة ، تم تطوير عدة طرق لحل مشكلة DPD. كل واحد له نطاق محدد أو مصمم لحل مشكلة مختلفة ، ولكن كل منهم يهدف إلى تقليل عدد انحرافات المواد الأولية الناتجة.

تم التعبير عن مشكلة DPD بطرق مختلفة من قبل العديد من الباحثين. قدم لينهارت وشامير [17] أقصى تغطية لمشكلة DPD (MC-DPD) ، بهدف إيجاد كتاب تمهيدي يغطي العدد الأقصى من تسلسلات الإدخال. اختيار الاشعال مقيد بالحد من الانحطاط الأقصى. كما ذكروا الحد الأدنى لمشكلة انحلال DPD (MD-DPD) ، حيث يكون الهدف هو إيجاد أساس مع الحد الأدنى من الانحلال الذي يغطي جميع تسلسلات الإدخال. لحل MC-DPD قاموا بتطوير برنامج HYDEN [18]. وي وآخرون. [19] طور برنامج DePiCt الذي يستخدم التجميع الهرمي للكتل البروتينية لتصميم البادئات. روز وآخرون. [20] طور طريقة للبادئات الهجينة المنحلة-غير المتولدة ، حيث تتدهور منطقة 3-والمنطقة 5 عبارة عن مشبك إجماع. تم تنفيذه في برامج CODEHOP [21] و iCODEHOP [22] واستخدم للبحث عن أعضاء جدد من عائلات البروتين ولتحديد وتوصيف الجينومات الفيروسية. وصف Balla و Rajasekaran [23] طريقة لمتغير MD-DPD يتسامح مع أخطاء عدم التطابق ، ويتم تنفيذه في برنامج minDPS. يعالج البرنامجان PT-MIPS و PAMPS بشكل أساسي مشكلة التصميم التمهيدي المتدهور المتعدد. الهدف من هذه البرامج هو إيجاد الحد الأدنى من البادئات المتدهورة التي تغطي جميع تسلسلات الإدخال ، مع الأخذ في الاعتبار أن أيا منها قد يكون أكثر انحطاطًا من قيمة الإدخال.

في هذه الدراسة ، تم اقتراح طريقة جديدة لحل مشكلة DPD ، حيث يتم تحويل التركيز بعيدًا عن الحد الأدنى العالمي من التمهيدي المتحلل لصالح تعظيم قيمة الدرجة التي تحتوي على انحلال ولكنها مرجحة بقربها من 3 نهاية التمهيدي . هذا يقلل من الانحطاط في هذه النهاية مع السماح بمزيد من الحرية في المواقف المتبقية. بموجب هذا ، قد لا تكون أفضل بادئات التسجيل هي الأقل انحطاطًا ، ولكنها تأخذ في الاعتبار قيودًا بيولوجية لا يتم أخذها في الاعتبار بشكل كبير في الطرق الأخرى. الطرف 3 هو موقع التثبيت الأساسي لأنه حيث يبدأ البوليميراز نشاطه. من وجهة نظر استراتيجية ، يجب اتخاذ قرار بشأن السماح أو عدم السماح بالتدهور في هذه الغاية. من المحتمل أن يضمن وجود انحلال عند الطرف 3 تنوعًا أكبر في التسلسلات التي يجب اكتشافها. ومع ذلك ، في نفس الوقت ، فإنه يقلل من نسبة التمهيدي المحددة لتسلسل معين. لذلك ، قررنا أن نكون صارمين للغاية في البحث عن المناطق المحفوظة وتقليل مقدار الانحطاط المتضمن في هذه النهاية. إذا كانت مجموعة التسلسلات المدخلة كبيرة بدرجة كافية ، فمن المحتمل جدًا أن يتم أيضًا حفظ المنطقة التي تم تحديدها على أنها محفوظة بين جميع التسلسلات المعروفة في أي عضو جديد في العائلة.

2. استراتيجية البحث والتسجيل التمهيدي

يمكن استخدام الطريقة المعروضة هنا بدءًا من الحمض النووي أو محاذاة تسلسل البروتين (الشكل 1 (أ)). إذا كان الإدخال عبارة عن DNA ، فقد تمت محاذاة التسلسلات للحصول على إجماع عالمي واحد من الحمض النووي المنحل. إذا كان الإدخال عبارة عن محاذاة بروتينية ، فسيتم ترجمة كل بروتين من المحاذاة إلى تسلسل الحمض النووي المنحل. تم الجمع بين جميع تسلسلات الحمض النووي المتدهورة في إجماع عالمي واحد من الحمض النووي المنحل. يغطي تسلسل الإجماع هذا جميع تسلسلات الإدخال المفترضة التي يمكن أن تكون أصل كل تسلسل بروتين (الشكل 1 (ب)). أيضًا ، قد يرمز تسلسل الإجماع للأحماض الأمينية التي لم يتم اكتشافها في التسلسلات المعروفة. هذا أمر لا مفر منه نظرًا لنوع انحطاط الشيفرة الجينية.


(أ)
(ب)

تقنية التمهيدي الخاصة بالتسلسل (PCR-SSP)

يعد تحليل مستضد كريات الدم البيضاء البشرية (HLA) عنصرًا مهمًا في البحث المناعي والبحوث الصيدلانية الحيوية. تقليديا ، تم استخدام السمية الدقيقة (MLCT) وقياس التدفق الخلوي (FC) على نطاق واسع للكشف عن أنواع HLA. يتم استخدام طرق البيولوجيا الجزيئية المختلفة أيضًا بسبب قيود وأوجه القصور في MLCT و FC ، في حين أن هذا الخيار المكلف يصعب إلى حد ما بالنسبة للمختبرات التي تعاني من ضائقة مالية. لمساعدة العلماء في حل هذه المعضلة ، Biolabs الإبداعية قام بتوحيد تقنية التمهيدي الخاص بالتسلسل (PCR-SSP) وطبقها على اكتشاف نوع HLA ، والذي يمكن تحديده عن طريق التحليل الكهربي.

مقدمة في طباعة الأنسجة HLA

يشير HLA عمومًا إلى نظام مستضد الكريات البيض بأكمله ، والذي تتحكم فيه الجينات الموجودة على الذراع القصيرة للكروموسوم 6 ، وهو جزء من المنطقة الوراثية المعروفة باسم مجمع التوافق النسيجي الرئيسي (MHC). يتمثل الدور الفسيولوجي لـ HLA بشكل أساسي في التحكم في التعريف الذاتي لجهاز المناعة ومقاومة غزو الكائنات الحية الدقيقة. يضمن جين HLA الحكم الدقيق والقدرة على الهجوم على التهديدات الخارجية للجسم بفضل تنوعه الشديد. نظرًا لأن بعض مستضدات HLA يتم التعرف عليها في جميع أنسجة الجسم (بدلاً من خلايا الدم فقط) ، فإن تحديد مستضدات HLA يوصف باسم "تصنيف الأنسجة". تقليديا ، تم تصنيف مستضدات HLA وتعريفها من خلال التقنيات المصلية التي تعتمد على الحصول على مستحضرات الخلايا الليمفاوية الحية والمضادات المناسبة لتحديد مدى توفر مستضدات HLA. في السنوات القليلة الماضية ، تم استخدام تقنية الحمض النووي على نطاق واسع واستبدلت تدريجياً التكنولوجيا المصلية في التطبيقات السريرية في مجال التوافق النسيجي وعلم الوراثة المناعية. بدأت العديد من المعامل في تطوير وتطبيق العديد من طرق الحمض النووي المختلفة لنوع الحمض النووي للكشف عن أليلات HLA.

الشكل 1 مبدأ PCR-SSP.

PCR-SSP لطباعة الأنسجة HLA

ظهرت تقنية PCR-SSP لأول مرة في أوائل التسعينيات واستندت إلى تضخيم أنظمة الطفرات الحرارية (ARMS). مبدأ هذه الطريقة هو أن التمهيدي المتطابق تمامًا يكون أكثر كفاءة في تفاعل PCR من واحد أو أكثر من البادئات غير المتطابقة. يتم تحديد الخصوصية من خلال استخدام البادئات الخاصة بالتسلسل ، حيث يمنع عدم تطابق قاعدة واحدة 3 بوصات بدء تفاعل غير محدد. نظرًا لعدم وجود نشاط نوكلياز خارجي 3 'إلى 5' لبوليميراز Taq ، حتى أزواج التمهيدي لا تصلب على وجه التحديد ولا يتم تضخيمها بكفاءة. لذلك ، سيتم تضخيم الأليل المطلوب فقط ، ومن ثم يمكن الكشف عن المنتج المضخم بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام.

Biolabs الإبداعية طورت تقنية PCR-SSP لتوفير خدمات طباعة HLA لمجموعة واسعة من الباحثين. تكلف هذه الطريقة أقل بكثير من الطرق التحليلية التقليدية مثل قياس التدفق الخلوي ، مما يسمح لك بالحصول على نتائج تجريبية على المدى القصير وجعل مشروعك أكثر كفاءة.

إذا كانت لديك أي أسئلة حول خدمة تصميم المتجهات ، يمكنك الاتصال بنا عبر البريد الإلكتروني أو إرسال استفسار إلينا للعثور على حل كامل.

جميع الخدمات والمنتجات المدرجة للاستخدام البحثي فقط. لا تستخدم في أي تطبيقات تشخيصية أو علاجية.


كيفية تصميم برايمر PCR

ويكي هاو هي "ويكي" ، تشبه ويكيبيديا ، مما يعني أن العديد من مقالاتنا شارك في كتابتها مؤلفون متعددون. لإنشاء هذه المقالة ، عمل المؤلفون المتطوعون على تحريرها وتحسينها بمرور الوقت.

تمت مشاهدة هذا المقال 14،826 مرة.

تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو تقنية لها تطبيقات مختلفة في مجال البحث والطب والطب الشرعي. يضخم جزء الحمض النووي للفائدة. كما أنه اختبار حساس لتشخيص المرض والتنميط الجيني. تشتمل المكونات الأساسية لنظام التفاعل على قالب DNA ، ومحلول منظم ، وثلاثي فوسفات الديوكسي ريبونوكليوزيد (dNTPs) ، و Taq polymerase ، وزوج من البادئات (الأول الأمامي والعكسي). تعمل البادئات المصممة بشكل صحيح على تقليل التكلفة والوقت الذي يقضيه في التجريب. Primer-BLAST هي أداة قوية للعثور على مواد أولية خاصة بالقالب. هذه الأداة مجانية الاستخدام ولا تتطلب تثبيت البرامج أو مهارات البرمجة. توضح هذه المقالة كيفية تصميم بادئات PCR مع مثال على Primer-BLAST.


المواد والأساليب

ربط الحمض النووي وحسابات الطاقة القابلة للطي

نحن نستخدم النماذج الميكانيكية الإحصائية للحمض النووي لحساب ألفة الربط بين ثنائيات الحمض النووي ذات الصلة في تفاعل PCR (8 ، 9). تستخدم هذه النماذج البرمجة الديناميكية لتقييم استقرار العديد من التكوينات التي يرتبط فيها جزيء واحد بالآخر عبر 1 bp على الأقل ، وتقوم بدمج ثبات كل هذه المطابقات في توقع الاستقرار النهائي. نحن نستخدم مجموعة من المعلمات الديناميكية الحرارية (11) التي تحدد المساهمات النشطة من الاقتران الأساسي والتكديس ، وكذلك الحلقات الداخلية ودبابيس الشعر ، للاستقرار الديناميكي الحراري لجزيئات الحمض النووي المزدوجة.

تم تطوير نهج ميكانيكي إحصائي مختلف للتنبؤ بطاقة الطي لجزيء الحمض النووي (10). هناك العديد من خوارزميات البرمجة الديناميكية المتاحة لاشتقاق ثبات نهائي مطوي. نحن لا نأخذ في الاعتبار المطابقات القابلة للطي مع العقدة الكاذبة ، حتى نتمكن من استخدام خوارزمية البرمجة الديناميكية ذات التعقيد الحسابي لـ ا(ن 4) في طول التسلسل المطوي بدلاً من ا(ن 7) (16) عند النظر في العقد الزائفة. نحن نستخدم نفس المعلمات الديناميكية الحرارية المستخدمة في حسابات الطاقة الملزمة.


تصميم واختبار البرايمر

أداة تصميم PCR والتسلسل التمهيدي. قاعدة بيانات التمهيدي والاختبار.

بنيت في قاعدة البيانات الأولية والمتصفح

قم بسحب وإسقاط البرايمر في تنسيق FASTA أو جدول البيانات أو Genbank. بمجرد تحميلها ، ستحصل عليها جميعًا كأدوات تمهيدية في قاعدة البيانات القابلة للبحث الخاصة بك. سوف يعلمك Geneious Prime إذا كان لديك بالفعل بادئات تتطابق مع تسلسل جديد.

أداة تصميم برايمر أنيقة

تصميم PCR وتسلسل الاشعال وتحقيقات التهجين ، لأي منطقة مستهدفة أو تسلسل كامل ، مباشرة على المحاذاة والتجمعات في عارض التسلسل الجيني. قم بإضافة وإزالة التمديدات إلى تسلسل التمهيدي قبل أو أثناء أو بعد عملية التصميم.

اختبار خصوصية التمهيدي

كن واثقًا من أن مواد التمهيدي الخاصة بك سوف تلتصق فقط في مكان واحد مع تحديد تلقائي لأي مواقع ربط إضافية خارج الهدف تم العثور عليها عند استخدام Test with Saved Primers. ستتم إضافة المعلومات غير المستهدفة للمستند الذي تم اختباره إلى التعليقات التوضيحية الجديدة في التمهيدي.

اختبر بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل مقابل أي تسلسل قبل طلبك

Geneious Prime مليء بالميزات لمساعدتك في تحقيق أقصى استفادة من تجارب PCR.

  • شاشة للخصائص الفيزيائية ودبابيس الشعر وثنائيات البرايمر
  • حدد جميع منتجات PCR في تسلسل أو أي اثنين من البادئات في زوج لاستخراج منتج تلك البادئات
  • 5 & ​​# 8242 التمديد التمهيدي - تمديد التمهيدي مع موقع تقييد أو ذيل polyA أو أي تسلسل مخصص آخر
  • احسب ديناميكيًا نقطة انصهار الحمض النووي لمنطقة محددة لتصميم التمهيدي اليدوي
كيف أدلة
دروس

Primer Design & # 8211 تعرف على كيفية استيراد وتصميم واختبار مواد أولغنوكليوتيد الأولية وأزواج البرايمر ومجموعات البرايمر والأزواج / المسبار.

TOPO Cloning & # 8211 تعرف على كيفية محاكاة استنساخ TOPO باستخدام أساليب TA أو Blunt أو Directional.

المزيد من الميزات الأولية الجينية

CRISPR & # 8211 ابحث عن مواقع CRISPR ، وقم بتصميم توجيه RNAs وتحليل نتائج التحرير الخاصة بك

المحاذاة - قم بإجراء محاذاة زوجية ومتعددة للحمض النووي أو البروتين باستخدام خوارزميات موثوقة ، بما في ذلك MAFFT و ClustalW.

الاستنساخ الجزيئي - عرض خرائط البلازميد ، والتعليق على المتجهات تلقائيًا ، والعثور على استخلاص مواقع التقييد ، وربطها ، وتنفيذ استنساخ Golden Gate و Gibson و Gateway.

BLAST / NCBI - اتصل بـ NCBI و PubMed ، وأرسل التسلسلات مباشرة إلى GenBank ، وتسلسلات بلاست ، وابحث في قاعدة البيانات الخاصة بك.


المواد والأساليب

طريقة MRPrimer

يتكون تدفق MRPrimer من سبع خطوات (الشكل 1). يأخذ MRPrimer قاعدة بيانات تسلسل الحمض النووي ومجموعة من قيود التصفية كمدخلات ، وبعد ذلك ، على مدى سبع خطوات ، يقوم بإرجاع جميع أزواج التمهيدي الممكنة والصالحة الموجودة في قاعدة البيانات. أدناه ، نشرح كل خطوة بالتفصيل.

الخطوة 1 (جيل مرشح التمهيدي): تأخذ الخطوة 1 مجموعة من متواليات الحمض النووي وتستخرج كل التكرارات اللاحقة الممكنة للأطوال بين الحد الأدنى للطول والحد الأقصى للطول من كل تسلسل ، كباقات مرشحة. يتم تحديد هذه الأطوال من قبل المستخدمين كواحد من قيود الترشيح التمهيدي الفردي. تستخرج هذه الخطوة أيضًا البادئات التكميلية العكسية الخاصة بهم أثناء وضع علامات عليها بـ "البادئات العكسية".

الخطوة 2 (تصفية واحدة): تطبق الخطوة 2 ستة قيود ترشيح لبادئ واحد على كل أساس مرشح تم تمريره من الخطوة 1. يتم تصفية البادئات التي تنتهك أي قيد ترشيح. تشمل القيود درجة حرارة الانصهار ، ومحتوى GC ، والتكامل الذاتي ، والتكامل الذاتي ثلاثي الأطراف ، والمخلفات المتجاورة ، وطاقة جيبس ​​الحرة. تم بالفعل التحقق من طول التمهيدي في الخطوة 1. يمكن تحديد كل هذه القيود من قبل المستخدمين عند بدء البرنامج. لحساب درجة حرارة الانصهار وقيمة الطاقة المجانية ، اعتمدنا النموذج الديناميكي الحراري الأقرب (24) ، وهو نموذج محسّن للنموذج السابق (25) المستخدم في Primer3Plus (9).

الخطوه 3 (5 ′ ترشيح تهجين متقاطع): تزيل الخطوة 3 التمهيدي المرشح الذي يماثل أي تسلسل خارج الهدف في النهاية 3 ولديه عدد قليل من حالات عدم التطابق (حتى أربعة حالات عدم تطابق) عند الطرف 5 ، وبالتالي ، قد يتم التهجين المتقاطع مع التسلسل غير المستهدف بسبب التشابه الكبير بينهما ، خاصة عند الطرف 3. تأخذ هذه الخطوة مدخلين ، الخريطة 1، وهو ناتج الخطوة 1 (أي جميع التكرارات اللاحقة المحتملة) ، و الخريطة 2، وهو ناتج الخطوة 2 (أي مجموعة من البادئات المرشحة التي اجتازت جميع قيود التصفية الفردية). أثناء إجراء ربط كل الأزواج بين المجموعتين ، إذا كان التمهيدي من Map1 والبادئ من Map2 متطابقين مع بعضهما البعض باستثناء نهاية 5 ، يتم تصفية التمهيدي من Map2. نقدم مثالاً على هذه الخطوة في الشكل التكميلي S2.

الخطوة 4 (ترشيح التهجين المتقاطع العام): تستبعد الخطوة 4 التمهيدي المرشح الذي يشبه أي تتابع خارج الهدف. تأخذ هذه الخطوة مدخلين ، الخريطة 1، وهو ناتج الخطوة 1 (أي جميع التكرارات اللاحقة المحتملة) و الخريطة 2، وهو ناتج الخطوة 3 (أي مجموعة من البادئات المرشحة التي اجتازت كلاً من قيود الترشيح الفردية وقيد ترشيح التهجين المتقاطع 5). نشير إلى عدد المخلفات غير المتطابقة كـ #عدم تطابق. أثناء القيام بربط كل زوج بين مجموعتين ، إذا كان التمهيدي من الخريطة 1 وكتاب تمهيدي من الخريطة 2 متطابقة باستثناء #mismatch ، التمهيدي من الخريطة 2 تمت تصفيته. لحساب هذا بكفاءة ، تقسم هذه الخطوة كل أساس إلى مجموعة من القطع الأصغر (تسمى البذور). وفقًا للنظرية ، تسلسل الطول م مع على الأكثر ك يجب أن تحتوي حالات عدم التطابق على بذرة مطابقة تمامًا لما لا يقل عن ⌊م/(ك + 1) ⌋ مخلفات (26-28). جميع البادئات من الخريطة 1 و الخريطة 2 يتم جمع بذرة مشتركة من خلال عملية خلط ورق اللعب لـ MapReduce (الشكل التكميلي S1). بعد ذلك ، تتحقق هذه الخطوة من قيود الترشيح العامة للتهجين المتقاطع على كل مجموعة من البادئات التي لها بذرة مشتركة. نقدم مثالاً على هذه الخطوة في الشكل التكميلي S3.

الخطوة 5 (مكررة إزالة): بعد الخطوة 4 ، ربما لا يزال هناك بادئات موجبة كاذبة تنتهك قيود التصفية العامة للتهجين المتقاطع. على سبيل المثال ، في الشكل التكميلي S3 ، يمر التمهيدي (د) بالخطوة 4 عندما يتم فحصه مقابل التمهيدي (أ). ومع ذلك ، يجب تصفيته لأنه مشابه جدًا للبرايمر (ب). من أجل القضاء على مثل هذا التمهيدي ، تقوم هذه الخطوة بفحص كل بذرة من البرايمر. على سبيل المثال ، من بين ثلاث بذور من التمهيدي (د) عند تكرار # عدم التطابق = 2 ، فإن البذرة المشتركة بين البادئات (د) و (أ) لا تنتهك قيود التصفية العامة للتهجين المتقاطع ، في حين أن البذرة الشائعة بين البادئات ( د) و (ب) ينتهكها. وهكذا ، تزيل الخطوة 5 التمهيدي (د). يتم تنفيذ سلسلة الخطوتين 4 و 5 بشكل متكرر حتى يتم الانتهاء من التحقق من قيد ترشيح التهجين المتقاطع العام.

الخطوة 6 (تصفية الزوج): تعيد الخطوة 6 ترتيب نتيجة الخطوة 5 إلى مجموعة من مجموعات البادئات ، حيث تتكون كل مجموعة من البادئات المستخرجة من نفس تسلسل الحمض النووي ، باستخدام عملية خلط ورق اللعب لـ MapReduce (الشكل التكميلي S1). بعد ذلك ، تقسم هذه الخطوة البادئات المرشحة لكل مجموعة إلى مجموعتين ، مجموعة من البادئات الأمامية ومجموعة من البادئات العكسية ، باستخدام العلامات التي تم تناولها في الخطوة 1 وإجراء حساب الارتباط الذاتي بينهما. في حساب الانضمام الذاتي ، تطبق هذه الخطوة خمسة قيود ترشيح على كل زوج تمهيدي مرشح. تشمل هذه القيود اختلاف الطول ، وفرق درجة حرارة الانصهار ، وحجم المنتج ، وتكامل الزوج ، وتكامل الزوج ثلاثي الأطراف. يمكن للمستخدمين تحديدها جميعًا عند بدء البرنامج.

الخطوة 7 (تصنيف): أزواج التمهيدي التي تم تمريرها من الخطوة 6 قد لا تكون فعالة بنفس القدر حتى إذا كانت تفي بجميع القيود المحددة. وهكذا ، فإن الخطوة الأخيرة من MRPrimer ، أي الخطوة 7 ، تحدد ترتيبهم عن طريق حساب درجة جزاء لكل زوج من التمهيدي. يتم تحديد الترتيب ضمن تسلسل (تسلسلات) هدف محددة ، وبالتالي يمكن للمستخدمين بسهولة اختيار زوج التمهيدي الأعلى 1 لكل تسلسل هدف. يتبع حساب درجات الجزاء طريقة Primer3Plus (9) ، والتي تضيف درجات جزاء لسبعة قيود للاشعال الفردي وخمسة قيود لأزواج التمهيدي. بشكل عام ، بالنسبة للقيود التي لها نطاق (مثل درجة حرارة الانصهار) ، فإن القيمة المتوسطة لها أقل عقوبة. بالنسبة للقيود الأخرى (مثل التكامل الذاتي) ، فإن أصغر قيمة ، عادةً صفر ، لها أقل عقوبة. يتم تسوية كل نتيجة جزاء لكل قيد بين 0 و 1. تتمتع أزواج التمهيدي ذات الدرجات المنخفضة بترتيب مرتفع للتسلسل المستهدف المقابل.

الوصول إلى MRPrimer

يتوفر أحدث إصدار من MRPrimer على http://MRPrimer.com. الكود المصدري لـ MRPrimer متاح مجانًا بموجب GNU General Public License (GPL) الإصدار 3.0.

التحقق من اكتمال وطريقة ترتيب MRPrimer

لإظهار اكتمال وتفوق MRPrimer من حيث عدد أزواج البرايمر المصممة ، نقارن نتائج MRPrimer مع PrimerBank ، وهي واحدة من أكبر قواعد البيانات الخاصة بالبادئات التي تم بناؤها وتحديثها على مدار السنوات العديدة الماضية (6 ، 7 ، 29 ، 30). يستخدم PrimerBank قواعد بيانات جينات الإنسان والفأر لمشروع NCBI RefSeq (31-33). هناك إصدارات متعددة من قاعدة بيانات RefSeq ، محددة حسب تواريخ إصدارها. لسوء الحظ ، فإن إصدار قاعدة بيانات RefSeq المستخدمة في PrimerBank قديم وبالتالي لم يعد متاحًا. وبالتالي ، فإننا نستخدم أقدم إصدار متاح للمقارنة لأنه الإصدار الأكثر تشابهًا مع الإصدار المستخدم في PrimerBank. يحتوي هذا الإصدار (الذي تم إصداره في 07 نوفمبر 2007) على ما مجموعه 22942 تسلسل مرنا بشري وما مجموعه 27305 تسلسل مرنا بالماوس. لإجراء مقارنة عادلة ، نستخدم نفس مجموعة قيود التصفية التي تم استخدامها لإنشاء PrimerBank (6) تم تلخيص هذه القيود في الجدول التكميلي S1.

بالإضافة إلى ذلك ، لإظهار فعالية طريقة الترتيب MRPrimer ، قمنا باستخراج أزواج التمهيدي التي تم التحقق من صحتها والتي تغطي على وجه التحديد متواليات مستقبلات حاسة الشم للماوس (OR) من PrimerBank وقمنا بتحليلها باستخدام طريقة التصنيف MRPrimer. من بين 27305 تسلسل mRNA للماوس من قاعدة بيانات RefSeq ، هناك 990 من الجينات أو الماوس. لقد بحثنا عن معرفات NCBI الجينية لتلك الجينات في PrimerBank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html) وجمعنا 778 زوجًا تمهيديًا تم التحقق من صحتها تغطي 768 فأرًا أو جينًا. يمكن أن يجد MRPrimer أيضًا 772 زوجًا من أصل 778 زوجًا من البرايمر ، ولذا يمكننا تصنيف 772 زوجًا من البرايمر ، وهي شائعة بين PrimerBank و MRPrimer ، وفقًا لطريقة التصنيف الخاصة بـ MRPrimer. كشفت نتائج الترتيب عقلانية طريقة الترتيب لدينا. لم يتم العثور على ستة أزواج من التمهيدي بواسطة MRPrimer لأن التسلسلات الستة المحتوية عليها غير موجودة في إصدار قاعدة بيانات RefSeq (التي تم إصدارها في 07 نوفمبر 2007) المستخدمة في تجاربنا.

تحليل qPCR لـ MRPrimer

للتحقق من جودة أزواج التمهيدي التي صممها MRPrimer ، أجرينا تجارب qPCR باستخدام قاعدة بيانات الماوس CCDS بدلاً من قاعدة بيانات RefSeq (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/CcdsBrowse.cgi). يوفر معيارًا ذهبيًا لمواقع منطقة الترميز (34 ، 35). في مجموعات بيانات CCDS ، يوجد حاليًا ما مجموعه 29064 تسلسلًا للحمض النووي للجينات البشرية (آخر تحديث كان 29 نوفمبر 2013) وما مجموعه 23874 تسلسل الحمض النووي لجين الفأر (التحديث الأخير كان 07 أبريل 2014). استخدمنا جينات الفأر في المقام الأول لتحليلنا qPCR.

اخترنا عشوائيًا 96 جينة OR و 99 جينًا غير OR (بما في ذلك مستقبلات الفرمون ، وبروتينات G ، والقنوات الأيونية ، وجزيئات الإشارة ، وما إلى ذلك). وهكذا ، أجرينا ما مجموعه 195 تجربة qPCR. لكل جين ، اخترنا أفضل زوج تمهيدي لهذا الجين ، وفقًا لطريقة التصنيف MRPrimer. نلخص البادئات الأمامية والخلفية المصممة والمختارة تلقائيًا بواسطة MRPrimer في الجداول التكميلية S2 و S3. اتبعنا إرشادات MIQE (36) لتجارب qPCR.

تحليل مقارن بين MRPrimer و PrimerBank

لإثبات فعالية وتفوق MRPrimer لـ qPCR ، أجرينا تحليلات qPCR والتسلسل وقارننا النتائج مع تلك التي تم الحصول عليها باستخدام PrimerBank. نظرًا لأن البادئات لكل من MRPrimer و PrimerBank نجحت بسهولة في تضخيم التسلسلات المستهدفة العادية ، قمنا بمقارنة أدائها باستخدام متواليات الهدف "الصعبة" ، أي الجينات التي تحتوي على العديد من المناطق المتجانسة ، وبالتالي ، غالبًا ما تفشل في تجارب qPCR (30). تشكل الجينات أو أكبر عائلة متعددة الجينات في الثدييات (37). تشترك هذه الجينات في العديد من المناطق المتجانسة وبالتالي من الصعب تصميم أزواج أولية صالحة لها (30). أبلغ عدد من الدراسات عن التعبير عن نسب الأرجحية في الأنسجة الشمية وكذلك غير الشمية (38 ، 39). بالنسبة لمثل هذه الدراسات ، فإن qPCR باستخدام أزواج التمهيدي الصالحة هو طريقة فعالة وبسيطة للكشف عن الجينات أو (38 ، 39).

لتحضير جينات الماوس أو ، بحثنا عن معرفات NCBI الجينية للماوس أو الجينات من قاعدة بيانات CCDS في PrimerBank وجمعنا 860 زوجًا تمهيديًا تم التحقق من صحتها ، كل منها يضخم جينًا واحدًا أو. قمنا أولاً بفحص خصوصيتها باستخدام PrimerBlast. من بين 860 زوجًا من التمهيدي ، كان 599 زوجًا من التمهيدي ذات جودة عالية (أي خصوصية عالية). كانت هذه الأزواج الـ 599 التمهيدي مطابقة بنسبة 100٪ للجينات المستهدفة المتوقعة المقصودة وإمكانية مطابقة الجين غير المستهدف لم تكن أكثر من 80٪. من بين 261 زوجًا تمهيديًا المتبقية ، كان 96 زوجًا متطابقًا بنسبة 100 ٪ مع الجينات المستهدفة المتوقعة ولم تكن إمكانية مطابقة الجين المستهدف أكثر من 85 ٪. تعتبر هذه الأزواج الـ 695 (599 زائد 96) من أزواج التمهيدي محددة للغاية للجينات المستهدفة. من بين أزواج التمهيدي المتبقية ، تم مطابقة 75 زوجًا من التمهيدي بنسبة 95 ٪ ، وكان 69 زوجًا من التمهيدي متطابقًا بنسبة 90 ٪ مع كل من الجينات المستهدفة وغير المستهدفة. يمكن لهذه الأزواج الـ 144 (75 زائد 69) من التمهيدي تضخيم الجينات المستهدفة جنبًا إلى جنب مع الجينات غير المستهدفة (أي هدف خاطئ أو متعدد الأهداف). اخترنا حوالي 6٪ من الأزواج المقابلة لـ 695 جينًا عالي التحديد (أي 40 زوجًا تمهيديًا) وحوالي 24٪ من الأزواج المقابلة لـ 144 جينًا أقل تحديدًا (أي 34 زوجًا أوليًا). بعد ذلك ، اخترنا 74 زوجًا تمهيديًا من نتائج MRPrimer لنفس الجينات الـ 74. The selection ratios differed (6 versus 24%) because the 695 genes are relatively easy to amplify, whereas the 144 genes are relatively hard. We also note that the 74 OR genes used for this experiment are distinct from the 96 OR genes in the above experiment furthermore, they represent harder target sequences. We summarize the forward and backward primers for the 74 genes of MRPrimer and PrimerBank used in our experiments (Supplementary Table S4).

To identify amplified samples, we compared the sequences of qPCR amplicons with the expected gene sequences using NCBI BLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) and checked the percent identity between the two sequences. For BLAST analysis, we applied the following criteria, used in a previous study ( 30). If more than 50% of the length of an expected PCR product sequence matches with only the expected target sequence, multiple genes or another gene with 100% identity between the sequences, it is considered to be target-specific, multiple-target أو wrong target, respectively. Finally, if a qPCR product sequence does not match with at least 50% of the length of its expected target sequence, it is considered to be a sequencing failure.


Primer Design

Given a DNA sequence, PRIMER adopts the following naming conventions: While the program will be searching for appropriate primers, three subsequent "status" indicators will be showing how much percentage of the search has been done. This is reported both graphically (using red and green combination, changing from left to right by approaching completion) and with digits.

    looking at the dots
    The horizontal grid represents location of the first 5' base of a forward primer in the Plus Strand, with the 5' end on the left side and the 3' end on the right side.

The vertical grid represent the location of the first 5' base of a reverse primer in the Minus Strand, with the 5' end on the bottom side and the 3' end on the top side

Thus each dot in the grid represents a combination of forward and reverse primers.

Therefore, the more distant are the dots from the upper left corner of the graph, the larger is their PCR product.

  1. the primer pair (one reverse and one forward) with the most similar melting temperature (and thus more ideal condition for its hybridization) gets a green color,
  2. while the one with largest difference gets a red color
  3. Any primer pair with intermediate values gets a intermediate colour
  • Start base
  • تسلسل
  • Tm (Melting Temperature)
  • GC % (Percentage of G or C)
  • Hairping propensity (maximum number of adjacent bases which self-pair)
  • Self pairing (maximum number of adjacent bases which pair to another primer of the same sequence)
  • Label (containing or omissing the word "REJECTED").
  1. Tm outside range
  2. GC or N outside range
  3. missing required GC clamp
  4. exceeding cross-complementarity
  5. exceeding self-complementarity

المرجعية

The benchmark used the sample files distributed with Primer0.5. The PPC version of Primer0.5 as available at the www.mit.genome.wi.edu site was crashing on a PowerPC 7200/75 since probably had been compiled on a non PCI-bus architecture. Benchmarking had therefore been accomplished on a binary obtained by rebuilding the Mac version from the original C code. The binary so obtained (using Metrowerks 9.0 ) had been made with maximum optimization speed flags.

The comparison is being performed using all the public available Applet Viewers for Macintosh OS as well as the one available commercially by Metrowerk. Results are shown in Table 1:

In conclusion, the Java implementation of the algorithm described in Primer0.5 is between 3 and 6 times slower then the native C version, with differences largely given by the Java Virtual Machine that interprete the bytecodes.


SnapGene software allows easy planning and visualization of molecular biology procedures, including In-Fusion Cloning.

Takara Bio USA، Inc.
الولايات المتحدة / كندا: +1.800.662.2566 & bull Asia Pacific: +1.650.919.7300 & Bull Europe: +33. (0) 1.3904.6880 & bull Japan: +81. (0) 77.565.6999
لأغراض البحث فقط. ليس للاستخدام في إجراءات التشخيص. & نسخ 2021 Takara Bio Inc. جميع الحقوق محفوظة. جميع العلامات التجارية مملوكة لشركة Takara Bio Inc. أو الشركات التابعة لها في الولايات المتحدة و / أو البلدان الأخرى أو أصحابها المعنيين. قد لا يتم تسجيل بعض العلامات التجارية في جميع الولايات القضائية. يتوفر المنتج الإضافي والملكية الفكرية ومعلومات الاستخدام المقيد على takarabio.com.

Takara Bio Europe is a member of the Takara Bio Group, a leading life sciences company that is committed to improving the human condition through biotechnology. من خلال علاماتنا التجارية Takara و Clontech و Cellartis ، تتمثل مهمتنا في تطوير أدوات وخدمات مبتكرة عالية الجودة لتسريع الاكتشاف.


شاهد الفيديو: تفاعل البلمرة المتسلسل PCR (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Dousho

    ابدأ مع تسييل. وعظيم جدا!

  2. Vudogar

    مبروك ، ما الكلمات ... ، فكرة رائعة

  3. Malataxe

    هذا الرأي القيمة جدا

  4. Zugami

    أنا متأكد من أنك لست على حق.

  5. Hweolere

    هل يمكن إعادة صياغة هذا؟



اكتب رسالة