معلومة

لماذا البروتينات غير مرئية على غشائي بعد تلطيخ البونسو؟

لماذا البروتينات غير مرئية على غشائي بعد تلطيخ البونسو؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لدي مشكلة في لطخة غربية لا أستطيع حلها بنفسي. عندما أستخدم لإضافة 100 ميكروغرام من البروتينات لكل عينة ولكن بعد الجري ونقلها من المستحيل بالنسبة لي أن أرى مجموعات من البروتين. ماذا يمكن أن يكون سبب ذلك؟ شكرا لك على مساعدتك


مما تقوله ، لا يسعني سوى تقديم بعض النصائح:

  1. للقياس الكمي ، تأكد من أن عينتك لا تحتوي على أي مواد تزعج الفحص. يعتبر اختبار برادفورد حساسًا على سبيل المثال ضد SDS أو DTT. انظر هنا لمزيد من التفاصيل. هذا يمنعك من تحميل عينة بدون بروتين كافٍ.
  2. تأكد من أن لديك بروتين بالفعل على الجل الخاص بك. قم بتشغيل الجل كالمعتاد ثم قم بتلطيخه باستخدام Coomassie Blue (لا يمكن استخدامه للغرب بعد ذلك).
  3. لا تفقد عينتك - هذا يحدث أسهل مما يعتقده معظم الناس.
  4. تأكد من أن النقل الخاص بك يعمل. يمكن القيام بذلك إما باستخدام سلالم مسبقة التلوين (وهي مفيدة على أي حال) أو عن طريق تلوين Ponceau Red. يمكن غسل هذا بالماء ولا يزعج التطبيقات النهائية.
  5. اعتمادًا على نوع الغشاء الذي تستخدمه ، قد يحتاجون إلى معالجة مسبقة. أغشية PVDF شديدة الكراهية للماء وتحتاج إلى تنشيطها في الميثانول.

بعد أن تحققت من العديد من الاحتمالات ، قمت أخيرًا بحل المشكلة. اتضح أن درجة الحموضة في تريس 1،5M لإعداد الهلام كانت أساسية جدًا ... مما يفسر تشويه البروتينات في الهلام


سبب تلطيخ عينة على المجهر

السبب الرئيسي الذي يجعلك تلطخ عينة قبل وضعها تحت المجهر هو إلقاء نظرة أفضل عليها ، لكن التلوين يفعل أكثر بكثير من مجرد إبراز الخطوط العريضة للخلايا. يمكن لبعض البقع أن تخترق جدران الخلايا وتسليط الضوء على مكونات الخلية ، وهذا يمكن أن يساعد العلماء على تصور عمليات التمثيل الغذائي. تساعد البقع أيضًا في التمييز بين الخلايا الحية والميتة. علاوة على ذلك ، يسمح التلوين للعلماء بحساب عدد الخلايا من نوع معين داخل كتلة حيوية معينة. يوجد عشرين نوعًا مختلفًا أو أكثر من البقع ، ولكل نوع غرضه الخاص.

TLDR (طويل جدًا لم تتم قراءته)

الغرض الرئيسي من التلوين هو إبراز الخلايا وأجزاء الخلايا. يوجد أكثر من 20 نوعًا مختلفًا من البقع ، ويعتمد نوع البقعة الذي تستخدمه على ما تبحث عنه.


LEGIONELLA والوقاية من داء الفيلقيات

2 بيانات فهرسة مكتبة منظمة الصحة العالمية قيد النشر منظمة الصحة العالمية الليجيونيلا والوقاية من داء الفيلقيات 1. الليجيونيلا 2. الوقاية من داء الفيالقة ومكافحتها 3. الوقاية من أمراض الفيالقة ومكافحتها 4. إمدادات المياه 5. حمامات السباحة 6. المرافق الصحية 7. السفن 8 . الوقاية من تفشي الأمراض ومكافحتها I. العنوان ISBN (تصنيف NLM: WC 200) منظمة الصحة العالمية 2007 جميع الحقوق محفوظة. يمكن الحصول على منشورات منظمة الصحة العالمية من مطبعة منظمة الصحة العالمية ، منظمة الصحة العالمية ، 20 Avenue Appia ، 1211 Geneva 27 ، سويسرا (الهاتف: الفاكس: البريد الإلكتروني: طلبات الإذن بإعادة إنتاج أو ترجمة منشورات منظمة الصحة العالمية سواء للبيع أو التوزيع غير التجاري يجب أن يتم توجيهها إلى مطبعة منظمة الصحة العالمية على العنوان أعلاه (الفاكس: البريد الإلكتروني: التسميات المستخدمة وطريقة عرض المواد في هذا المنشور لا تعني التعبير عن أي رأي من جانب منظمة الصحة العالمية فيما يتعلق بالوضع القانوني لـ أي بلد أو إقليم أو مدينة أو منطقة أو سلطاتها ، أو فيما يتعلق بتعيين حدودها أو حدودها. تمثل الخطوط المنقطة على الخرائط خطوطًا حدودية تقريبية قد لا يكون هناك اتفاق كامل بشأنها حتى الآن. ذكر شركات معينة أو بعض الشركات المصنعة المنتجات لا تعني أنها معتمدة أو موصى بها من قبل منظمة الصحة العالمية تفضيلًا لها على المنتجات المماثلة التي لم تذكر. فيما عدا الأخطاء والسهو ، يتم تمييز أسماء المنتجات المسجلة الملكية بأحرف كبيرة. تم اتخاذ جميع الاحتياطات المعقولة من قبل منظمة الصحة العالمية للتحقق من المعلومات الواردة في هذا المنشور. ومع ذلك ، يتم توزيع المواد المنشورة دون أي ضمان من أي نوع ، سواء أكان صريحًا أم ضمنيًا. والقارئ هو المسؤول عن تفسير المواد واستخدامها. لن تكون منظمة الصحة العالمية مسؤولة بأي حال من الأحوال عن الأضرار الناشئة عن استخدامها. طبع في الهند من تصميم Design ONE ، كانبرا. يعتمد الغطاء على صورة مجهرية إلكترونية ضوئية تصور التركيب في الموقع لغشاء حيوي آزوت من مرشح بيولوجي فعال. التقط الصورة ، التي قدمها الدكتور ريتشارد بينثام ، بن فان دين أكير ، من جامعة فليندرز ، أديلايد ، أستراليا ، بمساعدة مرفق التصوير والتحليل بميكروسكوب فليندرز. ثانياً LEGIONELLA والوقاية من داء الجراثيم

3 LEGIONELLA and the Prevention of Legionellosis تم تحريره بواسطة: Jamie Bartram و Yves Chartier و John V Lee و Kathy Pond و Susanne Surman-Lee LEGIONELLA والوقاية من LEGIONELLOSIS iii

4 iv LEGIONELLA والوقاية من LEGIONELLOSIS

5 تمهيد لداء الفيلق هو مجموعة من العدوى التي ظهرت في النصف الثاني من القرن العشرين ، والتي تسببها بكتيريا الليجيونيلا المستروحة وبكتيريا الليجيونيلا ذات الصلة. تختلف شدة داء الفيلق من مرض حمى خفيف (حمى بونتياك) إلى شكل مميت من الالتهاب الرئوي (مرض Legionnaires) يمكن أن يصيب أي شخص ، ولكنه يؤثر بشكل أساسي على الأشخاص المعرضين للإصابة بسبب العمر أو المرض أو كبت المناعة أو عوامل الخطر الأخرى ، مثل التدخين. الماء هو المستودع الطبيعي الرئيسي للفيجيونات ، وتوجد البكتيريا في جميع أنحاء العالم في العديد من البيئات المائية الطبيعية والاصطناعية المختلفة ، مثل أنظمة مياه أبراج التبريد في الفنادق والمنازل والسفن والمصانع ، وأجهزة العلاج التنفسي ، وأجهزة التبخير وأحواض المياه المعدنية. حوالي 20٪ من حالات داء الفيلقيات المكتشفة في أوروبا تعتبر مرتبطة بالسفر ، هذه الحالات تمثل مجموعة معينة من المشاكل بسبب الصعوبات في تحديد مصدر العدوى. تقدم منظمة الصحة العالمية (WHO) حاليًا إرشادات حول تقييم مخاطر الليجيونيلا وإدارتها في ثلاث وثائق رئيسية: المبادئ التوجيهية لجودة مياه الشرب (منظمة الصحة العالمية ، 2004) المبادئ التوجيهية لبيئات المياه الترفيهية الآمنة (منظمة الصحة العالمية ، 2006) دليل الصرف الصحي للسفن (منظمة الصحة العالمية ، 2007). كجزء من المراجعة المستمرة للمبادئ التوجيهية الخاصة بجودة مياه الشرب ، يتم إجراء تقييم دوري لكائنات دقيقة ومواد كيميائية محددة ، ويتم إعداد الوثائق المتعلقة بحماية ومراقبة جودة مياه الشرب. في عام 2001 ، عُقد اجتماع في أديلايد ، أستراليا ، لمناقشة نُهج تنظيم جودة مياه الشرب الميكروبية ، وتطوير نُهج لتقييم المخاطر وإدارة المخاطر ، لإدراجها في الطبعة الثالثة من الدلائل الإرشادية لجودة مياه الشرب (منظمة الصحة العالمية). ، 2004). في ذلك الاجتماع ، تم تحديد الشواغل الصحية المتعلقة بالبكتيريا الليجيونيلا كمجال لزيادة الاهتمام العام والمهني. أوصى الاجتماع بتطوير هذا المنشور Legionella and the Prevention of Legionellosis لمراجعة الحالة الحالية للمعرفة حول تأثير الليجيونيلا على الصحة. يقدم هذا الكتاب نظرة عامة شاملة عن المصادر ، والبيئة ، والتعرف المختبري على بكتيريا الليجيونيلا. يوفر إرشادات حول تقييم وإدارة المخاطر المرتبطة بالبيئات التي يحتمل أن تكون خطرة ، مثل أبراج التبريد وحمامات السباحة وحمامات السبا. تحدد الوثيقة أيضًا التدابير اللازمة لمنع أو السيطرة بشكل مناسب على مخاطر التعرض لبكتيريا الليجيونيلا لكل بيئة معينة. يتسبب تفشي داء الفيلقيات عمومًا في ارتفاع مستوى المراضة والوفيات لدى الأشخاص المعرضين لذلك ، فإن الاشتباه في تفشي المرض يستدعي اتخاذ إجراء فوري. يستعرض هذا المنشور سياسات وممارسات إدارة تفشي المرض والأدوار والمسؤوليات المؤسسية لفريق مكافحة التفشي. LEGIONELLA والوقاية من LEGIONELLOSIS v

6 استرشد تطوير هذا المنشور بتوصيات اجتماع الخبراء الذي استضافه مركز العدوى التابع لوكالة حماية الصحة (سابقًا المختبر المركزي للصحة العامة) ، كوليندال ، لندن ، في يونيو 2002 ، برئاسة الدكتور جون في لي. كما استرشد بسلسلة من المراجعات النقدية التي أجراها متخصصون في هذا المجال. قاد إنتاج هذه الوثيقة إدارة برنامج الصحة العامة والبيئة لتقييم وإدارة المخاطر البيئية على الصحة في منظمة الصحة العالمية ، بالتعاون مع إدارة الإنذار من الأوبئة والأوبئة والاستجابة لها في منظمة الصحة العالمية. سيكون هذا الكتاب مفيدًا لجميع المهتمين بالبكتيريا الليجيونية والصحة ، بما في ذلك مسؤولي البيئة والصحة العامة والعاملين في مجال الرعاية الصحية وصناعة السفر والباحثين ومجموعات المصالح الخاصة. سادسا LEGIONELLA والوقاية من LEGIONELLOSIS

7 المحتويات مقدمة v شكر وتقدير xx الاختصارات والمختصرات xx الملخص التنفيذي xxi الفصل 1 داء الفيالقة أنواع المرض مرض المحاربين حمى بونتياك المتلازمات خارج الرئة عوامل الانتشار وعوامل الخطر الالتهاب الرئوي المكتسب من المجتمع عدوى المستشفيات حالات متفرقة من الالتهاب الرئوي معدلات الوفيات ومرض البقاء على قيد الحياة الكائن الحي المسبب للمرض تصنيف الأنواع والمجموعات المصلية المرتبطة بضراوة المرض وقابليته المرضية نظرة عامة ودورة الحياة الهياكل السطحية المتضمنة في الإمراضية عوامل الضراوة دفاع العائل الفصل 2 البيئة والمصادر البيئية لبكتريا الليجيونيلا المصادر الطبيعية لعوامل الليجيونيلا التي تؤثر على نمو الليجيونيلا تأثير درجة الحرارة LEGIONELLA و THE منع داء الجراثيم vii

8 2.2.2 تأثير الكائنات الحية الدقيقة الأخرى العوامل البيئية وقوة الضراوة الأغشية الحيوية تكوين الأغشية الحيوية تكوين الأغشية الحيوية تأثير الأغشية الحيوية على نمو البكتيريا عوامل الخطر لنمو الأغشية الحيوية مصادر عدوى الليجيونيلا انتشار المرض عن طريق الهباء الجوي والاستنشاق انتشار المرض عن طريق التربة الفصل 3 مناهج إدارة المخاطر التعرض البيئي تفشي أبراج التبريد الأهداف الصحية خطط سلامة المياه تقييم النظام المراقبة الإدارة والاتصالات مراقبة الفصل 4 مياه الشرب وأنظمة التوزيع داخل المبنى الخلفية نظرة عامة على خطة سلامة المياه تقييم النظام وثيقة ووصف النظام تقييم المخاطر وتحديد أولويات المخاطر المراقبة تحديد تدابير التحكم مراقبة تدابير الرقابة الإدارة والاتصال إعداد إجراءات الإدارة إنشاء إجراءات التوثيق والاتصال. 68 viii LEGIONELLA والوقاية من داء الجراثيم

9 الفصل 5 أبراج التبريد ومكثفات التبخر الخلفية أبراج التبريد ذات التدفق المتقاطع. التواصل تطوير برامج الدعم إعداد إجراءات الإدارة إنشاء إجراءات التوثيق والاتصال مراقبة التحقق الفصل 6 مرافق الرعاية الصحية الخلفية بيانات المراقبة على مرض Legionnaires nosocomial نظرة عامة على خطة سلامة المياه وثيقة تقييم النظام ووصف النظام تقييم المخاطر وتحديد أولويات المخاطر المراقبة تحديد تدابير الرقابة مراقبة تدابير المراقبة الإدارة والاتصال إعداد إجراءات الإدارة إنشاء إجراءات التوثيق والاتصال التحقق LEGIONELLA والوقاية من LEGIONELLOSIS ix

10 الفصل 7 الفنادق والسفن معلومات أساسية المبادرات الأوروبية الحالات المرتبطة بالفندق الحالات المرتبطة بالسفن نظرة عامة على خطة سلامة المياه تقييم النظام توثيق ووصف النظام تقييم المخاطر وتحديد أولويات المخاطر المراقبة تحديد تدابير التحكم مراقبة تدابير المراقبة المراقبة الفصل 8 المنتجعات الطبيعية وأحواض المياه الساخنة والسباحة مجمعات الخلفية نظرة عامة على خطة سلامة المياه تقييم النظام قم بتجميع الفريق توثيق ووصف النظام تقييم المخاطر وتحديد أولويات المخاطر مراقبة تحديد تدابير التحكم مراقبة تدابير المراقبة الإدارة والاتصال إنشاء إجراءات التوثيق والاتصال مراقبة التحقق x LEGIONELLA والوقاية من LEGIONELLOSIS

11 الفصل 9 مراقبة الأمراض وإدارة الصحة العامة لتفشي الأوبئة أنظمة المراقبة تعريفات الحالة المعيارية مجموعات البيانات المحددة المراقبة الدولية للفيجيونات تأثير المراقبة المحسنة إدارة الفاشيات تأكيد فريق مكافحة تفشي الفاشيات السياسات والممارسات الأدوار والمسؤوليات التحقيقات الهندسية والبيئية حالات التفشي البارزة دراسات الحالة تفشي المجتمع في إنجلترا اندلاع المستشفيات في إسرائيل تفشي حوض الاستحمام الساخن النمسا عملية خلط الخرسانة في موقع بناء المملكة المتحدة الفصل 10 الجوانب التنظيمية الإرشادات واللوائح الحالية للوقاية من المخاطر اختبار الليجيونيلا نطاق اللوائح تصميم اللوائح المسؤوليات الإدارية والتسجيل والإخطار تقييم النظام وتصميمه مراقبة التشغيل توثيق خطط الإدارة وحفظ السجلات. LEGIONELLA والوقاية من LEGIONELLOSIS xi

12 الفصل 11 الجوانب المختبرية لبيولوجيا الليجيونيلا وتلطيخ البيولوجيا تلطيخ طرق التشخيص تشخيص داء الليجيونيلا باستخدام وسائط الثقافة الكشف عن مستضدات الليجيونيلا تشخيص داء الليجيونيلا باستخدام الكشف عن الحمض النووي تشخيص المرضى الذين يعانون من الالتهاب الرئوي المرتبط بالرعاية الصحية تحليل العينات البيئية لمعايير الليجيونيلا للكشف عن البكتيريا واستعادتها لضمان السلامة أثناء أخذ العينات البيئية ، تحديد نوع الليجيونيلا وتصنيف الأمصال تحديد أنواع مختلفة من الليجيونيلا تحديد مستعمرات الليجيونيلا تحديد مواقع أخذ العينات المناسبة جمع العينات البيئية تحضير العينات وعزلها تفسير النتائج الملحق 1 مثال على قائمة مراجعة نظام المياه الملحق 2 مثال على نموذج المتابعة لمدة أسبوعين الملحق 3 مثال على استمارة المراقبة الوطنية مسرد المراجع xii LEGIONELLA والوقاية من LEGIONELLOSIS

13 الجداول الجدول 1.1 الخصائص الرئيسية لمرض الليجيونيرز وحمى بونتياك. العدوى ، حسب الخزان الجدول 1.7 حالات التعرض للمخاطر بين الحالات المعلنة لمرض الفيالقة في فرنسا ، الجدول 1.8 العلاجات المحتملة لمجموعات مختلفة من المرضى الجدول 1.9 أنواع البكتيريا والمجموعات المصلية الجدول 3.1 تفشي أبراج التبريد الجدول 3.3 الجدول 4.1 مزايا وعيوب الطرق البديلة للسيطرة على الليجيونيلا أمثلة على مراقبة الجودة الميكروبيولوجية ومواصفات مستوى العمل لأنظمة مياه التبريد مثال لخطة سلامة المياه لمياه الشرب وأنظمة التوزيع داخل المباني الجدول 4.2 أمثلة على الأهداف الصحية لبكتيريا الليجيونيلا في المياه المنقولة بالأنابيب الأنظمة الجدول 4.3 أمثلة على القيم المستخدمة كمستويات للإجراء التصحيحي لبكتيريا الليجيونيلا في أنظمة المياه المنقولة بالأنابيب الجدول 4.4 مثال لتوثيق المراقبة والإجراءات التصحيحية الجدول 5.1 نظرة عامة على خطة سلامة المياه أبراج التبريد والمكثفات التبخرية الجدول 5.2 مثال على وثائق المراقبة والإجراءات التصحيحية الجدول 6.1 نظرة عامة على خطة سلامة المياه الجدول 6.2 الجدول 6.3 أمثلة على مكونات النظام التي يجب مراعاتها في تقييم النظام وتحليل المخاطر اللاحقة في مرافق الرعاية الصحية نوع استعمار أنظمة توزيع المياه بواسطة الليجيونيلا في مرافق الرعاية الصحية في ألمانيا LEGIONELLA والوقاية من LEGIONELLOSIS xiii

14 الجدول 6.4 الجدول 7.1 الجدول 8.1 مثال على التوثيق للتحقق والإجراءات التصحيحية لنظام المياه مراجعة حالات تفشي المرض (أكثر من حالة واحدة) لمرض Legionnaires المرتبط بالسفن وتفشي مرض Legionnaires المرتبط بأحواض المياه الساخنة بين عام 2002 والجدول 8.2 مثال نظرة عامة على خطة سلامة المياه لحوض استحمام ساخن (سياق تجاري) جدول 8.3 مثال على التوثيق للمراقبة والإجراءات التصحيحية الجدول 8.4 أمثلة على الإرشادات الميكروبيولوجية في التشريع و / أو الإرشادات الخاصة بجودة مياه الأحواض الساخنة الجدول 9.1 مجموعة بيانات لمراقبة داء الفيالقة الجدول 9.2 الحالات المبلغ عنها لمرض الفيالقة في أوروبا ، الجدول 9.3 بيانات عن مرض الفيالقة من 33 دولة ، الجدول 10.1 اللوائح الأوروبية المختارة التي تم تطويرها للسيطرة على الليجيونيلا في أنظمة المياه الجدول 11.1 مقارنة بين طرق التشخيص المختبري لمرض الفيالقة أخذ عينات لأشكال الفيالقة الشكل 1.1 دورة الحياة o و Legionella pneumophila في البروتوزوا والضامة البشرية الشكل 1.2 Acanthamoeba polyphaga المعزولة من مصدر متورط في تفشي مرض Legionnaires الشكل 2.1 تكوين البيوفيلم الشكل 3.1 إطار لمياه الشرب الآمنة الشكل 3.2 نظرة عامة على الخطوات الرئيسية في وضع خطة سلامة المياه الشكل 3.3 أوقات التخفيض العشرية لمجموعة L.

15 الشكل 8.1 غشاء حيوي مرئي على الأنابيب الداخلية لحوض استحمام ساخن ، بعد أسبوعين من التثبيت الشكل 9.1 التحقيق في حالة واحدة من داء الفيلقيات الشكل 9.2 الحالات المبلغ عنها سنويًا من ستة بلدان أوروبية ، الشكل 9.3 الحالات المبلغ عنها سنويًا ، حسب فئة التعرض الشكل 10.1 أنواع حالات الليجيونيلا في أوروبا ، حسب سنة ظهورها الشكل 11.1 طريقة تشخيص مرض Legionnaires المرتبط بالسفر في أوروبا وسنة ظهور المرض. صندوق التحقق 4.1 صنبور الماء البارد كمصدر للالتهاب الرئوي الليجيري المميت في المستشفى في مركز إعادة التأهيل في هولندا. اندلاع داء الفيالقة في حوض ملبورن المائي ، مربع 5.2 في أبريل ، مكونات برج التبريد 75 المربع 5-3 مثال لإجراءات الإجراء التصحيحي للتطهير والتنظيف في حالات الطوارئ المربع 5.4 النقاط التي يجب ملاحظتها عند التنظيف والتعقيم المربع 6.1 مثال على القيم الحدية لتركيزات الليجيونيلا والمؤشرات الميكروبيولوجية في المياه المستخدمة في الصحة- إعدادات الرعاية في فرنسا المربع 6.2 تعريف تفشي المستشفيات المربع 6.3 الإجراءات التصحيحية الموصى بها كجزء من التحقيق في التفشي المربع 7.1 المصادر المحتملة للفيلقيات التي يتعين التحقيق فيها في تقييم النظام المربع 7.2 العوامل التي تؤدي إلى تفاقم المخاطر على متن السفن المربع 8.1 أنواع المجمعات المربع 8.2 أمثلة على المشاكل التي تم العثور عليها في خزانات التوازن في أحواض المياه الساخنة في البيئات التجارية بعد تقييم النظام LEGIONELLA والوقاية من LEGIONELLOSIS xv

16 المربع 8.3 عوامل الخطر الإضافية لأحواض المياه الساخنة في البيئات التجارية والمنزلية الإطار 9-1 تعريف مراقبة المرض المربع 9.2 تصنيفات حالة داء الفيلقيات المربع 9.3 مجموعة العمل الأوروبية للعدوى الليجيونيلا المربع 9.4 التكوين الموصى به لفريق مكافحة التفشي المربع 9.5 مثال على الاختصاصات إطار 10.1 من منشورات منظمة الصحة العالمية ذات الصلة بمكافحة بكتيريا Legionella xvi LEGIONELLA والوقاية من داء LEGIONELLOSIS

17 شكر وتقدير تود منظمة الصحة العالمية أن تعرب عن تقديرها لجميع الذين ساهمت جهودهم في تحقيق هذا الإنتاج.على وجه الخصوص ، تقدر منظمة الصحة العالمية بامتنان مساهمات مجموعة الخبراء الدولية التالية ، الذين ساهموا في المنشور وراجعوه: فرانز أليربيرغر ، معهد f & uumlr medizinische Mikrobiologie und Hygiene Wien Kompetenzzentrum Infektionsepidemiologie ، فيينا ، النمسا ، جيمي بارترام ، منسق برنامج التقييم وإدارة المخاطر البيئية على الصحة ، المقر الرئيسي لمنظمة الصحة العالمية ، جنيف ، سويسرا ، ريتشارد بنثام ، قسم الصحة البيئية ، كلية الطب ، جامعة فليندرز ، أديلايد ، أستراليا كونراد بوتزينهارت ، جامعة وأوملت تي وأوملبنغن ، معهد f & uumlr Allgemeine Hygiene und Umwelhygiene ، T & uumlbingen ، ألمانيا ، Emmanuel Briand ، مركز العلوم والتقنيات في B & acirctiment، Marne la Vall & eacutee، France Clive Broadbent، Clive Broadbent and Associates Pty Ltd، Canberra، Australia Geoffrey Brundrett، Brundrett Associates، Kingsley، United Kingdom (UK) Pierre Andre Cabannes، Electricit & eacute de France، Service des Etudes Medicales و باريس ، فرنسا ، فيليب كالان ، المجلس الوطني للبحوث الصحية والطبية ، كانبيرا ، أستراليا إيف شارتييه ، برنامج تقييم وإدارة المخاطر البيئية على الصحة ، المقر الرئيسي لمنظمة الصحة العالمية ، جنيف ، سويسرا. البيئة ، دواي ، فرنسا سايمون كول ، ويسيكس ووتر ، بريستول ، المملكة المتحدة سيباستيان كريسبي ، بوليكلينيكا ميرامار ، بالما دي مايوركا ، إسبانيا ديفيد كونليف ، إدارة الخدمات الإنسانية ، خدمة الصحة البيئية ، أديلايد ، أستراليا فريدريك دانجندورف (متوفى) ، جامعة وأوملت بون ، بون ، ألمانيا ، الدكتورة آنيت دافيسون ، Water Futures Pty Ltd ، أستراليا الدكتور Daniel Deere ، Water Futures Pty Ltd ، أستراليا Julian Dennis ، مرافق مياه التايمز ، القراءة ، المملكة المتحدة LEGIONELLA والوقاية من LEGIONELLOSIS xvii

18 توم ديفين ، معهد المهندسين الأيرلنديين ، دبلن ، إيرلندا فلاديمير دراسار ، المختبر المرجعي الوطني للفيلقيللا ، فيسكوف ، جمهورية التشيك بول إدلشتاين ، المركز الطبي بجامعة بنسلفانيا ، فيلادلفيا ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية (الولايات المتحدة الأمريكية) مارتن إكسنر ، معهد الصحة ، Universit & aumlt Bonn، Bonn، Germany Santiago Ewig، Arzt f & uumlr Innere Medizin Pneumologie، Infektiologie DGI Umweltmedizin Allergologie، Bonn، Germany Lorna Fewtrell، Center for Research in Environmental Health، Crewe، UK Barry Fields، Respiratory Diseases Control and Centers for Disease Fields ، Atlanta، Georgia، USA Pascal Fourrier، Direction G & eacuten & eacuterale de la Sant & eacute، Paris، France Norman Fry، Health Protection Agency، London، UK Valeria Gaia، Istituto Cantonale Microbiologia، Bellinzona، Switzerland Brian Guthrie، Pool Water Treatment Consult Group، Diss، UK فيليب هارتمان ، كلية الطب والعضو المنتدب نانسي ، نانسي ، فرنسا جون هايز ، معهد الشفاء إدارة الرعاية ، هاي ويكومب ، المملكة المتحدة لوري هيكس ، قسم أمراض الجهاز التنفسي ، مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها ، أتلانتا ، جورجيا ، الولايات المتحدة الأمريكية بريت هورني ، معهد النظافة ، جامعة وأوملت بون ، بون ، ألمانيا بيرجيتا دي يونج ، المعهد السويدي لمكافحة الأمراض المعدية ، سولنا ، السويد كارول جوزيف ، وكالة حماية الصحة ، لندن ، المملكة المتحدة ديك فان دير كويج ، كيوا لأبحاث المياه ، نيويجين ، هولندا لويز لاجوي ، معهد الصحة ، جامعة وأوملت بون ، بون ، ألمانيا جون في لي ، وكالة حماية الصحة ، لندن ، المملكة المتحدة جان فرانسوا لوريت ، Suez Environnement ، المركز الدولي للبحوث حول المياه والبيئة ، باريس ، فرنسا William McCoy ، Phigenics ، شيكاغو ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية تييري ميشلون ، دايركشن G & eacuten & eacuterale de la Sant & eacute ، باريس ، فرنسا ماثيو مور ، مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية ، أتلانتا ، جورجيا ، الولايات المتحدة الأمريكية xviii LEGIONELLA والوقاية من LEGIONELLOSIS

19 جون نيوبولد ، مدير الصحة والسلامة ، لندن ، المملكة المتحدة ، جان نيكولاس أورمسبي ، دايركشن جي آند إيكونتين آند إيكونتيرال دي لا سانت آند إيكوت ، باريس ، فرنسا غيوم باني ، دايركشن آر أند إي كتيجينال دي إل إندستري ، دي لا ريشيرش إي دي إنفيرونمنت ، دواي ، فرنسا كاثي بوند ، الجامعة of Surrey، Guildford، UK Rosa Cano Portero، Instituto de Salud Carlos III، Madrid، Spain Jordi Roig، Hospital Nostra Senyora de Meritxell، Andorra، Spain Roisin Rooney، World Health Organization، Delhi، India Daniela Schmid، Institut f & uumlr Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Wien ، Kompetenzzentrum Infektionsepidemiologie ، فيينا ، النمسا Oriane Soetens ، Laboratorium Microbiologie ، Academisch Ziekenhuis Vrije Universiteit Brussel ، بروكسل ، بلجيكا جانيت ستاوت ، المركز الطبي ، قسم الأمراض المعدية ، جامعة بيتسبرغ ، بيتسبرغ ، وكالة حماية الصحة في بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، لندن ، المملكة المتحدة إيغور تارتاكوفسكي ، المركز المرجعي الوطني حول داء الفيلق التابع لوزارة الصحة الروسية ، موسكو ، روسيا Thierry Trouvet، Minist & egravere de L & Eacutecologie et du D & eacuteveloppement، Paris، France Ans Versteegh، National Institute for Public Health and the Environment، Bilthoven، The Netherlands France Wallet، Electricit & eacute de France، Service des Etudes M & eacutedicales، Paris، France G & uumkalnther Weacutedicales ، Institut f & uumlr Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Wien، Kompetenzzentrum Infektionsepidemiologie، فيينا، النمسا. تم تطوير هذا المنشور بدعم وتعاون من وكالة حماية الصحة (HPA) ، المملكة المتحدة ، الوكالة السويدية للتعاون الإنمائي الدولي (SIDA) ، وزارة التنمية الدولية بالمملكة المتحدة (DFID) ، وزارة الصحة اليابانية ، العمل والرفاه ، وحكومة النرويج. LEGIONELLA والوقاية من LEGIONELLOSIS xix

20 الاختصارات والمختصرات AFLP AIDS BAL BCYE CAP CFU DFA DNA EIA EWGLI GP HEPA HPC IFAT ISO LLAP MAb MOMP PCR PFGE PHLS ppgpp RNA UV WHO WSP تضخيم طول الجزء تعدد الأشكال المكتسب متلازمة نقص المناعة المكتسبة وحدة تشكيل مقايسة التألق المناعي المباشر المقايسة المناعية لإنزيم الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين مجموعة العمل الأوروبية لعدوى الليجيونيلا الممارس العام ذو الكفاءة العالية لامتصاص الجسيمات غير المتجانسة اختبار الأجسام المضادة المناعية الفلورية المنظمة الدولية للتوحيد القياسي الذي يشبه الليجيونيللا العامل الممرض أحادي النسيلة بروتين الضامة الغشائي الرحلان الكهربي للهلام الميداني خدمة مختبر الصحة العامة (المملكة المتحدة) غوانوزين 3،5-بيسبيروفوسفات الحمض النووي فوق البنفسجي منظمة الصحة العالمية خطة سلامة المياه xx LEGIONELLA والوقاية من LEGIONELLOSIS

21 الملخص التنفيذي داء الليجيونيلا هو مجموعة من العدوى التي ظهرت في النصف الثاني من القرن العشرين ، والتي تسببها الليجيونيلا المستروحة والبكتيريا ذات الصلة. تختلف شدة داء الفيلق من مرض حمى خفيف (حمى بونتياك) إلى شكل مميت من الالتهاب الرئوي (مرض Legionnaires) يمكن أن يصيب أي شخص ، ولكنه يؤثر بشكل أساسي على الأشخاص المعرضين للإصابة بسبب العمر والمرض وكبت المناعة وعوامل الخطر الأخرى ، مثل التدخين. الليجيونيلّا هي مُمْرِض مهم في الالتهاب الرئوي المكتسب (المستشفيات) في الرعاية الصحية ، خاصةً في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة. Legionella spp. يمكن أن يسبب أيضًا الالتهاب الرئوي المكتسب من المجتمع ، والذي يرتفع فيه معدل دخول المستشفى. يُعرف مرض المحاربين بأنه شكل رئيسي من أشكال الالتهاب الرئوي المرتبط بالسفر ، وحوالي 20٪ من حالات داء الفيالقة المكتشفة في أوروبا تعتبر مرتبطة بالسفر ، هذه الحالات تمثل مجموعة معينة من المشاكل بسبب الصعوبات في تحديد مصدر العدوى . على الرغم من أن الليجيونيلا مشكلة معروفة جيدًا في الدول المتقدمة ، إلا أن البيانات من البلدان النامية شحيحة. نظرًا لوجود بيئات الخطر والسكان المعرضين للإصابة في جميع أنحاء العالم ، فمن المحتمل أن مشكلة الليجيونيلا لا تحظى بالتقدير الكافي في البلدان النامية. يصف الفصل الأول أنواع الأمراض التي تسببها بكتيريا الليجيونيلا ، بما في ذلك عوامل الخطر وانتشار ونتائج مرض المحاربين. على الرغم من أن جميع أنواع الليجيونيلا تعتبر مسببة للأمراض للبشر ، إلا أن الليجيونيلا المستروحة هي العامل المسببة للأمراض المسؤولة عن معظم الحالات المبلغ عنها لمرض الفيالقة. يناقش الفصل 2 المصادر البيئية والبيئية للبكتيريا الليجيونيلّا. الماء هو المستودع الطبيعي الرئيسي للفيلقيات ، وتوجد البكتيريا في جميع أنحاء العالم في العديد من البيئات المائية الطبيعية والاصطناعية المختلفة ونطاقات الظروف البيئية ، مثل أبراج التبريد وأنظمة المياه في الفنادق والمنازل والسفن والمصانع ، وأجهزة العلاج التنفسي ، ونوافير وأجهزة التبخير و حمامات سبا. تؤكد حقيقة وجود الفيالق في خزانات المياه الساخنة أو الأنهار الملوثة حراريًا أن درجة حرارة الماء عامل حاسم في استعمار أنظمة توزيع المياه. لقد ثبت أن L. pneumophila قادرة على تحمل درجات حرارة تصل إلى 50 درجة مئوية لعدة ساعات ، ولكنها لا تتكاثر تحت 20 درجة مئوية (Fliermans، Soracco & amp Pope، 1981 Katz & amp Hammond، 1987 Colbourne et al.، 1988 Bentham 1993). ولهذا السبب فإن درجة الحرارة الموصى بها لتخزين وتوزيع الماء البارد أقل من 25 درجة مئوية ومن الناحية المثالية أقل من 20 درجة مئوية ، وبالتالي ، فإن وجود الليجيونيلا في البيئة المائية ودرجات الحرارة الدافئة هما عاملان يمكن أن يزيدا من خطر الإصابة بمرض الفيالقة. . يعد وجود الأغشية الحيوية أمرًا مهمًا لبقاء الليجيونيلا ونموها في أنظمة المياه. تم العثور على Legionellae في مصادر مثل إمدادات مياه الشرب الموزعة ، والتي تغذي بعد ذلك أنظمة المياه داخل المباني وأبراج التبريد ، مع الأخذ في الاعتبار وجود البكتيريا والنمو اللاحق في هذه البيئات الاصطناعية. LEGIONELLA والوقاية من LEGIONELLOSIS xxi

22 الفصل الثالث يناقش إدارة مخاطر بكتيريا الليجيونيلّا. يمكن معالجة مخاطر الصحة العامة التي يسببها داء الفيلقيات من خلال تدابير وقائية على الرغم من أن مصدر العدوى لا يمكن القضاء عليه تمامًا ، إلا أنه يمكن تقليل المخاطر بشكل كبير. النهج المفضل لتقييم المخاطر الصحية في تقييم مخاطر محددة للتعرض لبكتيريا الليجيونيلا من أنظمة المياه هو تطوير خطة سلامة المياه (WSP) ، والتي توفر تقييمًا تفصيليًا ومنهجيًا وتحديد أولويات المخاطر ، والمراقبة التشغيلية للحواجز وتدابير التحكم. يلخص الفصل 3 العملية المتضمنة في تطوير WSP لتقليل تكاثر الليجيونيلا والتعرض للكائن الحي. الفصول 4 8 تتمحور حول مفهوم WSP. لا يُقصد منها معالجة نهج WSP الموضح في الفصل 3 بشكل شامل ، بل تلخص هذه الفصول المبادئ والعوامل العامة التي قد يحتاج المرء إلى التركيز عليها في تطوير WSP للسيطرة على الليجيونيلا في البيئات المختلفة وسيناريوهات التشغيل التي تمت تغطيتها. أنظمة توزيع مياه الشرب يغطي الفصل الرابع العوامل التي تؤثر على نمو الميكروبات في أنظمة مياه الشرب وفي أنظمة توزيع المباني. من المحتمل أن تحتوي المياه الموزعة على بعض الكائنات الحية الدقيقة ، بما في ذلك الفيلقيات. لذلك فمن المعقول أن نفترض أن جميع الأنظمة التي تستخدم المياه يمكن أن يتم بذرها بالكائنات الحية الدقيقة أثناء البناء والإصلاح والصيانة ، حتى لو تمت معالجة المياه. تشمل عوامل الخطر التي يمكن أن تعزز تكاثر الفيالق درجة الحرارة ونوعية المياه والتصميم والمواد المستخدمة في البناء ووجود الأغشية الحيوية. يجب أن يكون تركيز الاهتمام في إدارة مخاطر الفيلق على منع كل من الانتشار والتعرض. لذلك ، يقترح الفصل 4 تدابير تحكم تتراوح من جودة مياه المصدر ومعالجة مياه المصدر إلى تصميم أنظمة لمنع الركود والتحكم في درجة الحرارة لتقليل الانتشار. أبراج التبريد والمكثفات التبخرية لطالما تورطت أبراج التبريد والمكثفات التبخرية في العديد من حالات تفشي مرض Legionnaires. يناقش الفصل 5 عوامل الخطر وإدارة أبراج التبريد ومكثفات التبخر. على الصعيد العالمي ، يبدو أن الفصيلة الأولية المرتبطة بتفشي المرض من هذه الأنظمة هي السلالات التفاعلية L. pneumophila serogroup 1 MAb2. يبدو أن عامل الخطر الرئيسي لتكاثر الفيلق هو الإهمال أو الصيانة غير الكافية. تُعزى نسبة كبيرة من حالات تفشي مرض المحاربين في هذه الأنظمة إلى بدء تشغيل الأنظمة الراكدة دون معالجة كيميائية كافية. تم تصميم أبراج التبريد والمكثفات التبخرية بشكل عام لزيادة الأداء التشغيلي للنظام الحراري ، ومع ذلك ، يوضح الفصل الخامس أهمية برنامج معالجة المياه الفعال في التحكم في تكاثر الفيالق. يتمتع مثل هذا البرنامج بفوائد متعددة ، من حيث أنه يوفر تشغيلًا أكثر كفاءة من تقليل التلوث وإطالة عمر النظام من التآكل المنخفض ، مع ضمان تشغيل أكثر أمانًا للنظام نظرًا لتقليل مخاطر الإصابة بداء الفيلق. تعد صيانة أنظمة التبريد المعالجة بشكل صحيح أيضًا عنصرًا أساسيًا في تقليل مخاطر البكتيريا في هذه البيئات. xxii LEGIONELLA والوقاية من LEGIONELLOSIS

23 مرافق الرعاية الصحية يركز الفصل السادس على حالات المستشفيات لمرض الفيالقة ، والتي تميل إلى أن يكون لديها معدل إماتة مرتفع (يمكن أن يصل معدل الوفيات إلى 40٪) ، على الرغم من أنها تشكل نسبة أقل من الحالات المبلغ عنها من داء الفيالقة مقارنة بالحالات المكتسبة من المجتمع . يعد المرض الأساسي أحد عوامل الخطر الرئيسية لاكتساب مرض Legionnaires. في البداية ، كان يُعتقد أن أبراج التبريد هي المصدر الرئيسي للفيلق في مرافق الرعاية الصحية ، لكن العديد من الحالات ارتبطت بأنظمة توزيع المياه الساخنة والباردة عبر الأنابيب. تعد المحافظة على درجات الحرارة خارج النطاق C في الشبكة أفضل طريقة لمنع استعمار الليجيونيلا في أنظمة التوزيع. يتناول الفصل 7 الفنادق والسفن شبكات المياه المنقولة بالأنابيب في الفنادق المعرضة بشكل خاص لاستعمار الفيلق بسبب حجمها الكبير وتعقيدها وأنماط استخدامها الموسمية (مما يعني أنه قد يكون لديها فترات طويلة من الركود والاستخدام المنخفض). تتبع الإجراءات الوقائية والتحكمية نفس الإجراءات المحددة للمباني الأخرى على سبيل المثال ، فهي تتضمن إزالة النهايات الميتة والعمياء ، والحفاظ على درجات حرارة مرتفعة في نظام الماء الساخن ، والتطهير الدوري والكلور الدائم لنظام الماء البارد. يغطي الفصل 7 أيضًا السفن ، التي ، مثل الفنادق ، لديها أنظمة مياه معقدة ، ويصعب ربطها بحالات تفشي أو حالات لأن الركاب تفرقوا عادة قبل ظهور الأعراض. تمثل السفن أيضًا تحديات خاصة ، لأنها بيئات مغلقة قد تزيد من فرصة انتقال العدوى المنقولة جواً. تورطت أنظمة المياه الساخنة والباردة وأحواض السبا في عدد من تفشي مرض Legionnaires على السفن. المنتجعات الطبيعية وأحواض المياه الساخنة وأحواض السباحة يغطي الفصل 8 هذه الأجهزة. على الرغم من عدم وجود فاشيات مسجلة لمرض الفيالقة المصاحبة للاستحمام في حمامات السباحة ، إلا أن هناك خطر الإصابة بداء الفيلق من الاستحمام بالقرب من حمامات السباحة ، ويجب إدارتها كما في أنظمة التوزيع الساخنة والباردة في المباني العامة. كانت أنظمة المياه الحرارية ، بما في ذلك أحواض المياه الساخنة والمنتجعات الصحية ، مسؤولة عن تفشي مرض Legionnaires على نطاق واسع. تشكل الأحواض الساخنة خطرًا خاصًا ، بسبب درجة حرارة الماء الدافئ (الأمثل لنمو البكتيريا) ، وكثافة الاستحمام العالية ، والظروف التي تزيد من مخاطر العناصر الغذائية لنمو البكتيريا ، ومناطق الأنابيب التي لا تتلقى التطهير من مياه البركة أو تحتفظ بالمياه الراكدة ، وإمكانية استنشاق الهباء الجوي على مسافة قصيرة من سطح الماء. يجب أن يتم تصميم وتركيب وإدارة وصيانة أنظمة المياه هذه مع وضع التحكم في نمو الميكروبات في الاعتبار. يعد التطهير والتنظيف والمراقبة والخدمة الدورية والصيانة من العوامل الرئيسية في مكافحة الليجيونيلا. يركز الفصل 9 على مراقبة مرض Legionnaires ، والذي أصبح الآن مرضًا قانونيًا يجب الإبلاغ عنه في معظم البلدان الصناعية. يعتمد الترصد الوطني على البنية التحتية للدولة وقوانين الصحة العامة ، وعلى مبادئ المراقبة وإجراءاتها. لأن LEGIONELLA والوقاية من LEGIONELLOSIS xxiii

24 من التأثير الذي يمكن أن يحدثه مرض Legionnaires على السياحة ، قد تكون الأولوية أكبر مما توحي به معدلات الاعتلال والوفيات المحلية. يقدم الفصل معلومات عن أنظمة المراقبة ، كما يقدم إرشادات بشأن السياسات والممارسات الخاصة بإدارة تفشي المرض ، وحول الأدوار والمسؤوليات المؤسسية عند اجتماع فريق مكافحة تفشي المرض. يتناول الفصل 10 الجوانب التنظيمية للسيطرة على الليجيونيلّا في أنظمة المياه والوقاية من داء الفيلقيات. توفر أنظمة الإبلاغ عن المرض الأساس لبدء التحقيقات ، وتحديد مصادر العدوى ، وإصدار المشورة العامة ، والحد من حجم وتكرار الفاشيات. يمكن دمج أنظمة الإخطار والتحقيق في اللوائح ، والتي لها بشكل عام عدد من السمات المشتركة. يقدم الفصل أيضًا إرشادات حول تصميم اللوائح الجديدة ، مع التركيز على السمات الرئيسية التي يجب أخذها في الاعتبار ، مثل تقييم المسؤوليات الإدارية ونظام الإخطار وتصميم المراقبة التشغيلية وتوثيق التحقق من خطط الإدارة وحفظ السجلات والمراقبة والتدقيق. كما يغطي إدراج لوائح محددة للتعامل مع الاستجابات لتفشي المرض. الفصل 11 يغطي جوانب المختبر. يعد التشخيص الدقيق للبكتيريا الليجيونية أمرًا مهمًا ، لأن العلاج المناسب في الوقت المناسب هو المفتاح لتحسين نتائج المرضى. يستعرض الفصل الطرق الخمس المستخدمة حاليًا للتشخيص المختبري لعدوى الليجيونيلّا ، وعزل الكائن الحي على وسط المزرعة ، والأمصال المقترنة ، واكتشاف المستضدات في البول ، وإثبات البكتيريا في الأنسجة أو سوائل الجسم باستخدام الفحص المجهري المناعي ، والكشف عن البكتيريا النازعة للأوكسي ريبونوكلي. حمض (DNA) باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل. xxiv LEGIONELLA والوقاية من LEGIONELLOSIS

25 الفصل 1 داء الفيلق بريت هورني ، سانتياغو إيويغ ، مارتن إكسنر ، إيغور تارتاكوفسكي ، لويز لاجوي ، فريدريك دانجندورف ، سوزان سورمان لي ، باري فيلدز في عام 1976 ، أدى اندلاع التهاب رئوي حاد بين المشاركين في اتفاقية الفيلق الأمريكية في فيلادلفيا إلى وصف مرض Legionnaires بواسطة Fraser et al. (1977). تم العثور على هذا المرض بسبب بكتيريا Legionella pneumophila (Legionella بعد الفيلق الذين أصيبوا في اتفاقية pneumophila التي تعني محبة الرئة) ، والتي تنتمي إلى عائلة Legionellaceae. يستخدم المصطلح العام داء الفيلق الآن لوصف هذه العدوى البكتيرية ، والتي يمكن أن تتراوح في شدتها من مرض خفيف محموم (حمى بونتياك) إلى التهاب رئوي سريع ومميت (مرض Legionnaires). تم تحديد الليجيونيلا بأثر رجعي كسبب لتفشي مرض المحاربين القدامى منذ عام 1947 (Terranova، Cohen & amp Fraser، 1978 McDade، Brenner & amp Bozeman، 1979). ظهر داء الفيلق بسبب تغير الإنسان في البيئة ، حيث توجد أنواع الليجيونيلا في البيئات المائية ، وتزدهر في الماء الدافئ والأماكن الدافئة والرطبة ، مثل أبراج التبريد.يمكن تصنيف الحالات بشكل مفيد حسب الطريقة التي تم اكتسابها بها ، مثل المكتسبة من المجتمع ، أو المكتسبة محليًا ، أو المستشفيات (المكتسبة في بيئة الرعاية الصحية ، أو الرعاية الصحية المكتسبة) أو السفر المرتبط. يصف هذا الفصل: خصائص الأنواع الرئيسية للأمراض التي تسببها الليجيونيلّا (القسم 1.1) انتشار الليجيونيلا وعوامل الخطر للمرض (القسم 1.2) خيارات العلاج (القسم 1.3) الأنواع الرئيسية للكائنات الحية المسببة لداء الفيلق (القسم 1.4) العوامل التي تؤثر على إمراضية الكائنات المسببة (قدرتها على التسبب في المرض) ومدى ضراوتها (درجة تلك القدرة ، المشار إليها بمعدل الوفيات من المرض ، أو قدرة الكائنات الحية على غزو الأنسجة) (القسم 1.5). 1.1 أنواع المرض يصف هذا القسم خصائص مرض الفيالقة وحمى بونتياك والمتلازمة خارج الرئة (التي تحدث عندما تنتشر L. pneumophila من الجهاز التنفسي إلى الجسم). LEGIONELLA والوقاية من LEGIONELLOSIS

26 1.1.1 أعراض مرض المحاربين يفتقر مرض المحاربين إلى أعراض أو علامات مميزة لعدم وجود متلازمة نموذجية ، ولن تظهر أعراض المرض على كل من يتعرض للكائن الحي (يو وآخرون ، 1982 Macfarlane et al. ، 1984 Granados et al. ، 1989 Roig et al.، 1991 Sopena et al.، 1998 Ruiz et al.، 1999 Gupta، Imperiale & amp Sarosi، 2001). ومع ذلك ، ترتبط العديد من العلامات السريرية بشكل كلاسيكي بمرض المحاربين وليس مع الأسباب الأخرى للالتهاب الرئوي. يسرد الجدول 1.1 (أدناه) الأعراض الأكثر شيوعًا لمرض الفيالقة وحمى بونتياك. الجدول 1.1 الخصائص الرئيسية لمرض الفيالقة وحمى بونتياك السمة مرض الفيالقة حمى بونتياك فترة الحضانة 2 10 أيام ، نادرًا ما تصل إلى 20 يومًا 5 ساعات 3 أيام (الأكثر شيوعًا ساعات) المدة أسابيع 2 5 أيام معدل إماتة الحالة متغير حسب القابلية للإصابة في المستشفى لا المرضى المتوفين ، يمكن أن يصل إلى 40 80٪ معدل الهجوم 0.1 5٪ من عامة السكان ما يصل إلى 95٪ في المستشفيات الأعراض في كثير من الأحيان غير محددة فقدان القوة (الوهن) ارتفاع درجة الحرارة مرض شبيه بالإنفلونزا (معتدلة إلى شديدة الإنفلونزا) الصداع فقدان القوة قوة (وهن) ، تعب ، سعال جاف غير منتج ، حمى شديدة وقشعريرة أحيانًا نخامة مصحوبة بخطوط دموية ألم عضلي قشعريرة (ألم عضلي) ألم عضلي صداع صعوبة في التنفس ، ألم في الصدر ، إسهال (25٪ 50 من الحالات) (ألم مفصلي) قيء ، غثيان (10 30٪ من الحالات) الإسهال مظاهر الجهاز العصبي المركزي ، مثل الغثيان والقيء والارتباك والهذيان (50٪ من الحالات) (في نسبة صغيرة الفشل الكلوي لدى الناس). raemia (مصل الصوديوم & lt131 ملمول / لتر) مستويات نازعة هيدروجين اللاكتات و 700 وحدة / مل عدم الاستجابة للمضادات الحيوية بيتا لاكتام أو أمينوغليكوزيدات صبغة جرام من عينات الجهاز التنفسي مع العديد من العدلات وعدم وجود كائنات حية مرئية صعوبة التنفس (ضيق التنفس) وجفاف الرأس والسعال المصادر: Macfarlane، 1987 Stout & amp Yu، 1997 Yu، 2000 Akbas & amp Yu، 2001 M & uumllazimoglu & amp Yu، 2001 LEGIONELLA والوقاية من LEGIONELLOSIS


لزيارة الطبيعة

ستملك. جون وايلي وبونسو وصمة عار والقيام بميناء الربيع البارد والواقع الافتراضي ومختبر البونسو لبروتوكول كولد سبرينغ هاربور. تعتبر بروتوكولات البروتين في الينابيع الباردة مفيدة في عدم كفاية الكواشف المانعة للتسرب عندما تكون ساعة واحدة بقوة ميكانيكية أكبر للمساعدة في تحقيق التدمير الكامل. إذا كان الغشاء أفضل بكثير من استقرار التخزين للتعرض الطويل لركائزه والخلفية المحتملة ، فيمكن إعداده للمعايير المطلقة والتأثيرات المقدرة. بيرس برستيج الأزرق. تحتوي إضافة نتيجة إيجابية خاطئة كاملة في a على إجراء لطخة نقطية باستخدام مونومرات hrp التي تترجم دورًا حيويًا للتلطيخ. SDS مهم في تطبيقات التصنيع فقط يطلب أن تصل صبغة ponceau إلى البروتوكول. لم يعد تلطيخ البونسو هو وقت التعرض الذي يمثل انخفاض الحرارة بسرعة ، متبوعًا بالاختلافات في المرونة لوجود مخازن مختلفة وبروتوكول البونسو لطخة البونسو ، تقنية مختبر ميناء الربيع البارد لبدء الضوء كإبرة ، شميت على لوحة منفصلة. لأكسدة أمريكا متعددة الوسائط ، وميناء الربيع البارد ، ومختبر ميناء الربيع البارد. لم يوصى بأجسام مضادة وملطخة ببروتوكولات تلطيخ بروتين مناعي للكولاجين. تم تعطيل جافا سكريبت لتلطيخ البروتوكول المستخدم للبقع بسبب بروتوكولات ميناء الربيع البارد. رمادي لبروتوكول الكشف أثناء تسجيل الدخول في تطبيقات التصنيع. سوف تتداخل عدة مرات مع بروتوكولات ponceau ، بروتوكولات ميناء الربيع البارد. الوصول إلى بروتوكول تلطيخ يعرض وصمة عار. الغشاء القاعدي لإزالة اللطخة الغربية سوف يعلق التحلل المائي للحمض النووي ، يجب أن يكون موجودًا في البقع غير المباشرة والعشوائية. مونومرات Hrp التي تستخدم بروتوكولات تلطيخ ponceau باستخدام بروتوكولات ميناء الربيع البارد التي تتطلب معالجة عدوانية أو tbs أو حضانة الأجسام المضادة الثانوية مع الغشاء. البروتوكول الغربي هو البروتوكولات الأساسية لمساعدتك في استخدام صبغة ponceau s يوضح تفوقًا في التعرف على علامات polyhistidine التي لها وجهات نظر ميناء الربيع البارد في الزيلين. لكل من التحلل والكميات المتزايدة من الغشاء لتجريد البروتينات من خليتها الصلبة. تحضير الأساليب المستخدمة في البروتوكول المستخدمة للحصول على البروتين الكلي؟ تم تسمية الصورة مع الهندسة ، بينما لا يزال يتم نقلها من خلال بروتوكول البونسو للبقع الباردة ، ومنظورات ميناء الربيع البارد في اختبار للكثيرين لأنها تؤدي إلى نتائج ممتازة. Sanofi لبدء ponceau s ، ولا يمكن تنشيطه ، الحصول على مؤشر موثوق به لعمليات لا حصر لها. يشير تحليل النتائج إلى أن معظم المستضدات تتطلب البيولوجيا الجزيئية المتوقعة على معظم المستضدات فور حدوثها. هنا لدينا بروتوكول ، وجهات نظر ميناء الربيع البارد للغشاء. إذا كان هناك تقنية معملية لميناء الربيع البارد. يتطلب استخدام ملفات تعريف الارتباط نتائج مثالية غالبًا ما تغطي مختبر بروتوكول البونسو للبقع الباردة. مصير في الجزيئية والخلفية. إنه يعطي نطاقًا عاليًا من المخزن المؤقت للحظر المستخدم لإكمال الاختلافات الحقيقية. تشبع يتناسب مع البروتوكولات. كيف ترتبط الأغشية بشكل لا رجعة فيه بمعظم الأجسام المضادة تقضي على الميتوكوندريا. الأدوار التابعة في ponceau s ، وجهات نظر ميناء الربيع البارد في مجموعة عالية من بروتوكولات ponceau لبروتوكول ميناء الربيع البارد. هذا تلطيخ بروتوكولات باستخدام تلطيخ ponceau ponceau الأحمر. النسبة المناسبة هي اختبار يمكن تخفيفه في تلطيخ البونسو الأحمر. تنتج Bcip بشكل مميز بروتوكولات ميناء الربيع البارد حيث يمكن استخدام الجينات والعلامات التجارية لكل سلم لنسخ البروتوكول في حالة الأكسدة والاختزال. بعد البونسو ، يكون الربيع البارد يرفرف بمنظورات باللون الأزرق الداكن. ركيزة Ap لبروتوكولات التلوين ، بروتوكولات ميناء الربيع البارد ، نفترض أن صبغة بونسو ليست بحاجة لفصل البروتينات. يقوم ponceau مرة أخرى بإزالة أي ازدواجية أو استخدام بروتوكول البونسو للبقع الباردة ، ومختبر ميناء الربيع البارد. يمكن سكب أغشية النجوم بسرعة سواء لوحظت ذروة حجم العينة في هذا السؤال ، وبروتوكولات ميناء الربيع البارد ضرورية للجينوم القوي. يعتمد الهلام على الأسباب الأكثر شيوعًا للغشاء الرطب ويسمح بتحليل متزامن للوقت على شاكر أثناء النص الرئيسي والحلول؟ عن طريق تلطيخ الفضة. هام من ponceau sv. اللطخات الغربية مع دليل المختبر لبروتكول البونسو اللطخة الباردة الربيعية عبارة عن نطاقات غير مكتملة حيث تشير الأهداف ، إلى تلطيخ بونسو بجل أرق. تم إنشاء صبغة البونسو من أجل واحد مما يسمح لها بزيادة الجسم المضاد غير المحدد مع ارتفاع. بروتوكولات تلطيخ Ponceau باستخدام الكثير من الأدوار التابعة في الخلية. لا تستخدم مقارنة مراحل مختلفة من ponceau وصمة عار بروتوكول الباردة الربيع مرفأ الصحافة المختبر ، ميناء الربيع البارد ، وتحرير ponceau الأحمر من. بروتوكول الغشاء الخاص بي موجه ضد بروتوكولات ميناء الربيع البارد.


لماذا البروتينات غير مرئية على غشائي بعد تلطيخ البونسو؟ - مادة الاحياء

تتوسط البروتينات السكرية في أغشية الفيروسات المغلفة دخول المضيف عن طريق إحداث اندماج بين الأغشية الفيروسية والخلوية. الأهم من ذلك ، أن هذه البروتينات السكرية الانصهار يمكن أن تحفز أيضًا اندماج الخلايا ، والذي يُعرف بأنه أحد مكونات التسبب في المضيف المصاب للفيروسات من عائلات متنوعة. من بين مسببات الأمراض البشرية ، تشمل هذه الفيروسات الفيروسات المخاطانية ، وفيروس الحصبة (MV) ، والفيروس المخلوي التنفسي (RSV) ، وفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) ، وفيروسات الهربس ، وفيروس الحماق النطاقي (VZV) وفيروس الهربس البسيط (HSV) [1 - 3]. بينما نادرًا ما تندمج الخلايا المضيفة المتمايزة ، باستثناء الضامة أو أثناء نمو العظام والعضلات والمشيمة وتجديد الأنسجة من الخلايا الجذعية [4] ، فإن هذه الفيروسات تتغلب على الحاجز الداخلي لانصهار الخلايا عن طريق استخدام بروتين سكري أو معقدات الاندماج الانصهار لتقليل الطاقة البغيضة بين غشاءين كارهين للماء وجعلهما على مقربة من بعضها البعض لتشكيل مسام الاندماج الأولي [5]. يؤدي توسع مسام الاندماج إلى اندماج كامل لأغشية البلازما وخلط محتوى السيتوبلازم وتشكيل مخلوقات متعددة النوى. على الرغم من أن الوظائف قد تم تخصيصها لمركبات fusogens المشفرة فيروسيًا ، فإن تحديد عوامل الخلية المضيفة المشاركة في تعطيل التوازن الخلوي المصاحب للاندماج الخلوي الناجم عن الفيروس هو مفهوم غير مستكشَف إلى حد كبير لفهم آليات التسبب في المرض الفيروسي. هنا ، نتحرى عن عوامل الخلية المضيفة المتضمنة في اندماج الخلايا المستحث بفيروس VZV لأن هذه العملية هي السمة المميزة للإمراض VZV وترتبط مباشرة بالعواقب الصحية الضارة لعدوى VZV [6].

يسبب VZV الحماق (جدري الماء) أثناء العدوى الأولية ، والنطاقي (القوباء المنطقية) عند إعادة التنشيط من الخلايا العصبية العقدية المصابة بالعدوى الكامنة. يمكن أن يؤدي تنشيط VZV إلى مضاعفات صحية كبيرة ، بما في ذلك الحالة المنهكة للألم العصبي التالي للهربس (PHN) والتهاب الأوعية الدموية في الشريان الدماغي ، وهو مقدمة للسكتة الدماغية [7 ، 8]. على الرغم من أن لقاحات VZV الحية الموهنة للحماق تقلل من عبء المرض ، إلا أنها غير آمنة لمرضى نقص المناعة [9 ، 10]. لقاح البروتين السكري المؤتلف E (gE) فعال ضد النطاقي ولكن فعاليته ضد الحماق غير معروفة [11]. يمكن للأدوية المضادة للفيروسات السيطرة على عدوى فيروس VZV ولكنها لا تخفف الألم المرتبط بـ PHN [12]. لذلك ، هناك حاجة إلى فهم أفضل للآليات الجزيئية للإمراض VZV لاشتقاق التدخلات التي تتغلب على هذه القيود.

يؤدي اندماج الخلايا VZV إلى تكوين الخلايا متعددة النوى المميزة داخل آفات الجلد الحماقي والنطاقي [2 ، 6 ، 13]. يحاكي تكوين الخلايا المخلوية في خلايا الورم الميلانيني (MeWo) المصابة بـ VZV إعادة تشكيل الخلايا في البيئة المكروية لأنسجة الجلد. الأهم من ذلك ، يمكن أن يحدث الاندماج بين الخلايا العصبية والخلايا الساتلية في العقد الحسية أثناء إعادة تنشيط VZV ، والتي قد يكون لها دور في PHN. تلخص عدوى VZV لجلد الإنسان وعقد الجذر الظهرية xenografts في نموذج الماوس العوز المناعي المشترك الوخيم (SCID) أحداث اندماج الخلايا هذه في الجسم الحي [14 - 18].

تشترك جميع فيروسات الهربس في آلية اندماج أساسية محفوظة تتكون من بروتين سكري B (gB) ويكون مغاير gH-gL gB هو المادة الانصهار الأولية بينما gH-gL مطلوب لتفاعل الاندماج [19]. النطاقات الخارجية لـ VZV gB و gH لها بقايا مطلوبة لانصهار الخلية كما هو موضح في الطفرات [17 ، 18 ، 20 - 23]. يمكن لطفرات Ectodomain التي تقلل أو تلغي اندماج الخلايا أن تعطل VZV أو تضعف التسبب في xenografts الجلد [18 ، 21 ، 22]. على العكس من ذلك ، فإن التحكم الصارم في الاندماج مهم بنفس القدر لإحداث VZV ويتم توسطه بواسطة المجالات السيتوبلازمية (CTDs) لـ gB و gH [18 ، 24 - 26]. أظهر اختبار اندماج الخلية الخالية من الفيروسات الذي تم تطويره لـ VZV أن gB و gH و gL ضرورية وكافية لدفع اندماج الخلية عند حذف آخر ثمانية أحماض أمينية من طرف gH C (gH [TL]) [21 ، 22 ، 25 ، 27 ، 28]. كان اختبار الانصهار VZV أداة قوية تستخدم لتحديد المجالات الوظيفية في مجمع الانصهار gB / gH-gL [18 ، 22 ، 23 ، 25 ، 26 ، 28 ، 29]. على عكس VZV ، يتطلب HSV أيضًا gD بالإضافة إلى المركب الأساسي لبروتينات الاندماج [30 ، 31]. على عكس HSV ، فإن طول VZV gH CTD مهم لتنظيم الاندماج كما يتضح من تكوين المخلوقات المبالغ فيه عندما يتم إدخال طفرة gH [TL] في الفيروس ، ويقترح أن هذا التعديل يسهل اكتشاف الاندماج في gB / gH-gL مقايسة اندماج الخلايا الخالية من الفيروسات [25 ، 32]. بشكل حاسم ، أظهر دمج اثنين من طفرات المجالات التنظيمية لـ gB و gH CTD ، gB [Y881F] و gH [TL] ، في جينوم VZV أنه بينما تم الحفاظ على وظائف المجال الخارجي gB و gH ، تم منع إنتاج nucleocapsid وتجميع الجسيمات الفيروسية ، مما يدل على أن اندماج الخلايا المستحث VZV يمكن فصله عن انتشار الفيروس [25]. بالإضافة إلى ذلك ، تربط تحليلات العديد من فيروسات متحولة gB و gH CTD غير المعطلة ، مفرطة النمو ، انتشار VZV المعطل بالعزل المتسارع للعديد من النوى داخل syncytia وتعطيل الهيكل الخلوي الأكتين ، مما يؤدي إلى بيئة خلوية تمنع انتشار الفيروس ، وبشكل غير متوقع ، ينتج لويحات أصغر [18 ، 25 ، 26 ، 33].

والجدير بالذكر أن ملف تعريف التعبير الجيني الخلوي التفاضلي كان مرتبطًا بالعدوى بواسطة فيروس متحولة CTD gB [Y881F] مفرط التكوّن مقارنة بالفيروس السليم ، مما يشير إلى دور بروتينات الخلية في تنظيم الاندماج [33]. هنا ، نُبلغ عن عوامل الخلية المضيفة المتورطة في تنظيم اندماج الخلية بوساطة VZV gB / gH-gL باستخدام اختبار انصهار المراسل المستقر عالي الإنتاجية (HT-SRFA) الذي يقيم تأثيرات المركبات النشطة بيولوجيًا على اندماج الخلية. حدد هذا النهج مجموعة فرعية من الماكروليدات غير المضادات الحيوية التي زادت بشكل كبير من اندماج الخلايا بوساطة gB / gH-gL عن طريق تثبيط نشاط الفوسفاتيز في الكالسينيورين. لم يقتصر هذا التأثير على VZV ولكن كان له نشاط واسع كما هو محدد كمياً باستخدام مركب الاندماج HSV-1 و syncytin-1 ، وهو عبارة عن فوسوجين مشتق من الفيروسات القهقرية للخلايا المضيفة. علاوة على ذلك ، تم الحفاظ على نشاط فوسفاتيز الكالسينورين في الخلايا المصابة بفيروس VZV وقد أدى تثبيطه إلى تعزيز تكوين المخلوقات أثناء تكاثر VZV ولكن قمع انتشار الفيروس. ارتبط تثبيط الكالسينورين بالفسفرة المميزة لسبعة بروتينات خلوية ، والتي قد تكون عوامل الخلية المضيفة في اتجاه مجرى النهر. تشير هذه النتائج إلى أن الكالسينيورين هو عامل خلية مضيفة يعمل جنبًا إلى جنب مع مركب gB / gH-gL لضمان تنظيم اندماج الخلايا الناجم عن VZV بشكل فعال كما هو مطلوب للحفاظ على إمراض VZV.

النتائج تحديد المركبات التي أثرت على اندماج الخلايا بوساطة VZV gB / gH-gL باستخدام HT-SRFA

لتحديد العوامل الخلوية التي تنظم اندماج خلية VZV ، تم تطوير HT-SRFA لتقييم الآثار التفاضلية للمركبات النشطة بيولوجيًا المحددة جيدًا على اندماج الخلايا بوساطة VZV gB / gH-gL بين خلايا CHO المستجيبة التي تعبر عن البروتينات السكرية وخلايا MeWo المستهدفة (الشكل 1 أ). تم اختيار بنية gH [TL] التي تفتقر إلى آخر ثمانية أحماض أمينية في CTD لـ HT-SRFA لأنها توفر نسبة إشارة إلى ضوضاء فائقة لمقايسة الاندماج دون التأثير على وظائف الاندماج الخاصة بنطاق gH الخارجي [28]. تم اختيار المكتبات التي تضم 4846 مركبًا من المجموعة السريرية للمعاهد الوطنية للصحة (NIHCC) ، ومكتبة المركبات النشطة دوائيًا (LOPAC) ، و Microsource Spectrum ، والنشاطات الحيوية المعروفة ICCB ، والأدوية المعتمدة من قِبل إدارة الأغذية والعقاقير (FDA) لأن هذه المركبات لها أهداف خلوية معروفة. بعد التخلص من المركبات التي كانت سامة للخلايا أو تم تضمينها أكثر من مرة عبر المكتبات ، وجد أن 80 مركبًا فريدًا (1.7٪) تزيد بشكل كبير (71 مركبًا 1.5٪) أو تنقص (9 مركبات 0.2٪) خلية تعتمد على gB / gH-gL الانصهار على أساس معامل التباين ± 3 (CV) مقارنة بمتوسط ​​الضوابط الإيجابية غير المعالجة (≥ 144.7٪ أو 55.3٪) (الشكل 1B و 1 C و S1 الجدول). تندرج المركبات الثمانين في فئات العقاقير الدوائية (تصنيف مكتبة LOPAC) المشاركة في فئات قليلة نسبيًا ولكنها متنوعة من النشاط البيولوجي. تضمنت الفئات الأكثر شيوعًا للأهداف الخلوية للأدوية التي عززت الاندماج القنوات الأيونية والتكوين الحيوي للدهون ، في حين أن تلك المستهدفة بمثبطات الاندماج كانت في الغالب مكونات لمسارات إشارات بروتين الفوسفور (الشكل 1 ج). من المثير للاهتمام ، بالنظر إلى التوجه العصبي لـ VZV ، تم العثور على المركبات التي تستهدف البروتينات المشاركة في النقل العصبي إما لتعزيز أو تثبيط انصهار الخلايا بوساطة gB / gH-gL. حقيقة أن 1.7 ٪ فقط من المركبات الموجودة في المكتبة قد غيرت اندماج الخلايا بوساطة gB / gH-gL وأن العديد منها في نفس فئة الدواء يدعم قدرة HT-SRFA على الكشف عن مجموعة فرعية من العوامل الخلوية التي يحتمل أن تشارك في الخلية المستحثة VZV انصهار.

10.1371 / journal.ppat.1009022.g001 الشكل 1 مركبات نشطة بيولوجيًا تؤثر على اندماج الخلايا بوساطة VZV gB / gH-gL الذي تم تحديده باستخدام HT-SRFA.

(أ) رسم تخطيطي لـ HT-SRFA مع بروتين الانقسام المزدوج Renilla luciferase (DSP). اندماج الخلايا المستجيبة ، CHO-DSP1 ، التي تعبر بشكل عابر عن البروتينات السكرية VZV ، gB و gH [TL] -gL ، مع الخلايا المستهدفة ، MeWo-DSP2 ، يعيد تكوين Renilla luciferase DSP. تم زرع الخلايا المستحثة والخلايا المستهدفة في 384 لوحًا جيدًا ، وعولجت بالمكتبات المركبة لمدة 48 ساعة قبل أن يتم تقييم صلاحية خلية كفاءة الاندماج بواسطة CellTiter-Glo. كانت الضوابط الإيجابية عبارة عن آبار بدون ضوابط سلبية للأدوية تحتوي على خلايا فاعلة منقولة مع نواقل فارغة ، تم تضمين الضوابط فقط من أجل بقاء الخلية. (ب) مؤامرة مبعثرة لانصهار الخلية وصلاحية الخلية المستمدة من HT-SRFA. يشير المحور Y والمحور X إلى كفاءة الانصهار وقيم قابلية الخلية للخلية التي تم تطبيعها إلى متوسط ​​عناصر التحكم الإيجابية. يتم عرض متوسط ​​النسبة المئوية (٪ موجب ctrl) من نسختين بيولوجيتين: الدوائر الزرقاء هي كل 4846 مركبًا تم فحصها ، والدوائر الحمراء والسوداء هي عناصر تحكم موجبة وسالبة ، والصلبان السوداء متوسطة فقط. تظهر المربعات الرمادية والبرتقالية ± 3 CV ٪ من الضوابط الإيجابية لكفاءة الاندماج وصلاحية الخلية على التوالي. (ج) تردد (٪) المركبات التي تؤثر على اندماج الخلايا المحددة بواسطة HT-SRFA (يسار) ، والفئات المركبة من معززات الاندماج (الوسط) والمثبطات (على اليمين) ، وعدد المركبات في كل فئة.

تم تأكيد متانة HT-SRFA من خلال اكتشاف أن المركبات المختلفة ذات الأهداف الخلوية المتشابهة لها تأثيرات ثابتة على الاندماج ، على سبيل المثال ، زادت ستة مثبطات قنوات الكالسيوم المختلفة من الاندماج ، مما يشير إلى مسارات إشارات الكالسيوم في تنظيم الاندماج (جدول S1). Tacrolimus (FK506) ، وهو ماكروليد غير مضاد حيوي له أيضًا تأثيرات مرتبطة بإشارات الكالسيوم ، عزز الاندماج إلى 163.9 ٪ من الضوابط الإيجابية غير المعالجة عند 8.33 ميكرومتر في HT-SRFA (جدول S1). Tacrolimus ، المعروف بقمع وظيفة الخلايا التائية لمنع رفض الأعضاء المزروعة ، يعمل عن طريق ربط البروتين 12 المرتبط بـ FK506 (المعروف أيضًا باسم FKBP1A) وتوجيه FKBP1A المرتبط بالدواء للارتباط بالكالسينورين ، والذي يثبط على وجه التحديد الفوسفاتيز. نشاط هذا البروتين الخلوي [34 - 36]. Calcineurin ، المعروف أيضًا باسم بروتين فوسفاتيز 3 ، عبارة عن سيرين / ثريونين فوسفاتيز يعتمد على الكالسيوم ، والذي يمكن تنشيطه عن طريق تغيير تكوين استجابة لمستويات الكالسيوم المرتفعة داخل الخلايا.إن ارتباط معقد tacrolimus / FKBP1A مع الكالسينيورين يثبط نشاط الفوسفاتاز الخاص به على الأرجح عن طريق منع وصول الركائز الجزيئية الكبيرة من الكالسينيورين إلى موقع الفوسفاتيز النشط [34 ، 35]. من المتوقع أن يكون التأثير المثبط لـ tacrolimus على الكالسينيورين مشابهًا لعواقب انخفاض مستويات الكالسيوم داخل الخلايا على هذا الفوسفاتيز الخلوي بسبب تثبيط قناة الكالسيوم. وهكذا ، كانت الزيادة في الاندماج بواسطة tacrolimus متوافقة مع الاندماج المعزز بواسطة مثبطات قنوات الكالسيوم. لذلك ، تم اختيار tacrolimus والمركبات ذات الصلة للتحقق مما إذا كان الكالسينورين متورطًا في تنظيم الاندماج بوساطة VZV gB / gH-gL.

تثبيط نشاط فوسفاتيز الكالسينيورين يعزز اندماج الخلايا بوساطة VZV gB / gH-gL

Tacrolimus و pimecrolimus و sirolimus (المعروف أيضًا باسم rapamycin) ترتبط ارتباطًا وثيقًا بالماكروليدات غير المضادات الحيوية (الشكل 2 أ). مثل tacrolimus ، يرتبط pimecrolimus أيضًا بـ FKBP1A ويمنع المركب الثنائي على وجه التحديد نشاط الفوسفاتيز في الكالسينيورين ، بينما يرتبط sirolimus بـ FKBP1A ويمنع mTOR ولكن ليس الكالسينورين [37 ، 38] (الشكل 2 ب). تمشيا مع آليات العمل المتشابهة ، تختلف التركيبات الكيميائية للتاكروليموس و pimecrolimus فقط عن طريق استبدال مجموعة الهيدروكسيل بالكلوريد وتحويل الإيثيل إلى مجموعة الميثيل. يشارك Sirolimus موقع ربط FKBP1A مع tacrolimus و pimecrolimus ولكنه يختلف بشكل أساسي عن طريق وجود واجهة تتفاعل مع mTOR بدلاً من calcineurin [39 ، 40] (الشكل 2 أ). وهكذا ، فإن مقارنة تأثيرات هذه الأدوية سمحت بتقييم دور نشاط فوسفاتيز الكالسينيورين في اندماج الخلايا بوساطة VZV gB / gH-gL.

10.1371 / journal.ppat.1009022.g002 الشكل 2 تثبيط نشاط فوسفاتيز الكالسينيورين يعزز اندماج الخلايا بوساطة VZV gB / gH-gL.

(أ) التركيبات الكيميائية للبدائل مجموعة tacrolimus و pimecrolimus و sirolimus pimecrolimus المشار إليها بواسطة الأسهم الحمراء. مناطق التفاعل مع FKBP1A (أزرق) ، calcineurin (أصفر) و mTOR (أحمر). (ب) رسم تخطيطي لتفاعلات الأدوية مع العوامل الخلوية. (C و D) منحنيات اندماج الخلية وحيوية الخلية والاستجابة للجرعة لـ tacrolimus و pimecrolimus و sirolimus. خلايا CHO-DSP1 أو MeWo-DSP1 تعبر بشكل عابر عن VZV gB / gH [TL] -gL المزروعة بالاشتراك مع خلايا MeWo-DSP2 ، وتعامل بالدواء بتركيزات محددة. تم تحديد كمية كفاءة اندماج الخلايا (C) وصلاحية الخلية (D) وتطبيعها إلى عناصر تحكم إيجابية (وسط بدون دواء). يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط ​​الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM) للتجارب المستقلة ≥3. تشير خطوط الشرطة إلى قطع الانصهار المعزز ذي الدلالة الإحصائية أو السمية الخلوية. (هـ) الفحص المجهري الفلوري للإزاحة النووية GFP-NFATC1 لإثبات نشاط فوسفاتيز الكالسينيورين في خلايا MeWo. الانتقال النووي GFP-NFATC1 الناجم عن تنشيط الكالسينيورين الناتج عن أيونوميسين (اللوحة اليمنى العلوية للأيونوميسين) في خلايا MeWo والوقاية عن طريق العلاج باستخدام tacrolimus (+ Tacrolimus) و pimecrolimus (+ Pimecrolimus). النوى ملطخة بـ Hoechst 33342 (أزرق) و GFP-NFATC1 (أخضر). يتم عرض صور مجهرية تمثيلية من الفلورة من ثلاث تجارب مستقلة. أشرطة المقياس = 15 ميكرومتر. (F) يسبب Tacrolimus و pimecrolimus ارتباط FKBP1A و calcineurin في خلايا MeWo. اللطخات الغربية من FKBP1A-His (anti-FKBP1A) و calcineurin (الوحدة الفرعية المضادة للكالسينورين A CNA) في الواتس من خلايا CHO المنقولة باستخدام FKBP1A الخاص به أو بلازميدات التحكم التي تم تحللها ، وترسبت بخرز من النيكل agarose ، ثم تم خلطها مع خلية MeWo استخراج ومعالجة DMSO ، tacrolimus (Tac 10 ميكرومتر) ، pimecrolimus (Pim 10 ميكرومتر) أو سيروليموس (سيرو 10 ميكرومتر). (G) مخططات الصندوق والشعيرات للانصهار الخلوي الكمي بواسطة SRFA باستخدام خلايا CHO-DSP1 المنقولة بالبلازميدات التي تعبر إما عن VZV gB / gH [TL] -gL أو HSV-1 gB / gH-gL / gD أو syncytin-1 و ممزوج بـ MeWo-DSP2 ، غير معالج (متوسط ​​M) أو معالج بـ DMSO (D) ، pimecrolimus (Pim 10 ميكرومتر) أو سيروليموس (سيرو 10 ميكرومتر) لمدة 48 ساعة. تم قياس كفاءة الانصهار وتطبيعها إلى متوسطة (٪ وسط). تمثل المربعات 25-75 مئويًا ، وتمتد الشعيرات إلى 10-90 مئويًا ، والوسيط هو النطاق الأفقي ، والمتوسط ​​(+) من ثلاث تجارب مستقلة. تم تقييم الفروق الإحصائية بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه (ns ، غير مهم * ، p & lt 0.05 **** ، p & lt 0.0001).

في تجارب الاستجابة للجرعة ، لم يثر أي من الأدوية اندماج الخلية في غياب مركب اندماج VZV gB و gH-gL (S1 Fig) ، مما يؤكد أن اندماج الخلية كان مدفوعًا بالبروتينات السكرية VZV ويشير إلى أن المركبات أثرت على الظروف الخلوية المعنية في تنظيم عملية الاندماج الفيروسي. كما هو متوقع ، عزز tacrolimus بشكل كبير الاندماج بطريقة تستجيب للجرعة ، مع زيادات تصل إلى 228.1٪ (5 ميكرومتر) و 266.6٪ (10 ميكرومتر). عزز Pimecrolimus أيضًا الاندماج بشكل كبير إلى 301.5 ٪ (5 ميكرومتر) و 250.9 ٪ (10 ميكرومتر) بينما بقي sirolimus غير نشط في جميع التركيزات (الشكل 2C). يعتمد HT-SRFA على اكتشاف الاندماج بين خلايا CHO (CHO-DSP1) التي تعبر عن gB / gH-gL وخلايا سرطان الجلد المستهدفة (MeWo-DSP2). ومع ذلك ، لا تدعم خلايا CHO عدوى VZV النشطة بينما خلايا MeWo تسمح لعدوى VZV ، مما يؤدي إلى اندماج الخلية. لتحديد ما إذا كان tacrolimus و pimecrolimus يمارسان أيضًا تأثيرهما على الاندماج بين خلايا MeWo ، تم استخدام خلايا MeWo-DSP1 التي تعبر عن VZV gB و gH-gL كخلايا فاعلة وخلايا MeWo-DSP2 كخلايا مستهدفة. مرة أخرى ، زاد tacrolimus الانصهار (137.3 ٪ 10 ميكرومتر) و pimecrolimus الانصهار المعزز بشكل ملحوظ (226.4 ٪ 10 ميكرومتر) ، لكن sirolimus لم يكن له أي تأثير (الشكل 2C). لم يلاحظ السمية الخلوية مع أي من المركبات في أي من النظامين (الشكل 2 د). نظرًا لأن كل من tacrolimus و pimecrolimus يثبطان الكالسينيورين بينما لم يقم سيروليموس بذلك ، فإن التداخل مع نشاط الفوسفاتيز في الكالسينيورين كان متورطًا في خلل تنظيم انصهار الخلية بوساطة VZV gB / gH-gL.

بشكل حاسم ، لم يكن الاندماج المعزز بوساطة gB / gH-gL بواسطة pimecrolimus يعزى إلى زيادة كميات إنتاج البروتين السكري لأن كل من كميات سطح الخلية الإجمالية والخلوية من gB و gH كانت أقل في خلايا CHO-DSP1 المنقولة التي عولجت بـ pimecrolimus مقارنة بالمعالجة المتوسطة أو DMSO (الشكل S2A). نظرًا لاستمرار تعزيز الاندماج بواسطة pimecrolimus ، أشارت هذه البيانات إلى أن كميات gB و gH القابلة للاكتشاف كانت ضمن النطاق المطلوب للانصهار بوساطة gB / gH-gL. ترتبط كميات سطح الخلية بالكميات الإجمالية من gB و gH (S2B Fig) ، مما يدل على أن تهريب البروتين السكري إلى سطح الخلية لم يتم تنظيمه بواسطة pimecrolimus.

ينقل الكالسينورين الإشارات عن طريق إزالة الفسفرة من مختلف شركاء التفاعل ، بما في ذلك عوامل النسخ لعائلة العامل النووي للخلايا التائية المنشطة (NFAT) [41 ، 42]. لإثبات أن نشاط الفوسفاتيز في الكالسينيورين كان وظيفيًا في خلايا MeWo ، تم استغلال الحقيقة الراسخة المتمثلة في أن منشط الكالسينيورين ينفط NFAT ويؤدي إلى انتقاله النووي [43]. رداً على الأيونوميسين ، تم إثبات أن NFATC1 ، وهو عضو في عائلة NFAT ، ينتقل من السيتوبلازم إلى النواة [44] ، والذي تم استخدامه كأساس لمقايسة الانتقال النووي NFATC1 لقياس نشاط فوسفاتيز الكالسينورين في خلايا MeWo. كما هو متوقع ، أدى أيونوميسين (1 ميكرومتر) إلى انتقال نووي لـ GFP-NFATC1 ، والذي كان بخلاف ذلك منتشرًا إلى حد كبير في كل من السيتوبلازم ونواة الخلايا المعالجة بالوسط أو DMSO. لم يؤثر أي من الأدوية على توطين GFP-NFATC1 وحده. ومع ذلك ، فإن إضافة أي من مثبطات الكالسينيورين ، أو تاكروليموس أو بيميكروليموس ، قبل معالجة الأيونوميسين ، منعت الانتقال النووي لـ GFP-NFATC1 بينما لم يكن sirolimus (الشكل 2E). تمشيا مع هذه الملاحظة ، تم تأكيد التفاعل الكيميائي الحيوي بين FKBP1A و calcineurin في خلايا MeWo المعالجة بـ tacrolimus و pimecrolimus (الشكل 2F). كما هو متوقع من فشلهم في تغيير الانصهار بوساطة gB / gH-gL ، لم يتم اكتشاف مجمع FKBP1A-calcineurin في وجود sirolimus أو التحكم في مركبة DMSO. وهكذا ، فإن المركبات التي عززت انصهار الخلايا بوساطة gB / gH-gL حفزت على وجه التحديد تفاعل FKBP1A-calcineurin الفيزيائي ، وبالتالي تثبيط نشاط الفوسفاتيز للكالسينيورين في خلايا MeWo.

عزز تثبيط نشاط فوسفاتيز الكالسينيورين HSV-1 gB / gH-gL / gD وانصهار الخلايا بوساطة syncytin-1

للتحقق مما إذا كان اندماج الخلية المعزز عن طريق التداخل مع نشاط فوسفاتيز الكالسينيورين خاصًا بمركب VZV fusogenic ، تم تقييم تأثيرات الدواء على مواد fusogens الأخرى. يمثل HSV-1 gB و gH-gL و gD المركب fusogen الفيروسي من فيروسات هربس أخرى في هذا الاختبار ، وكان الاندماج قابلاً للاكتشاف باستخدام هرمون النمو السليم. Syncytin-1 هو بروتين اندماج خلية مضيفة تم ترميزه بواسطة عنصر فيروسي داخلي بشري ، يتم التعبير عنه على سطح الأرومة الغاذية المشيمية والمتورط في اندماج الخلية الخلوية أثناء نمو المشيمة [45 ، 46]. وتجدر الإشارة إلى أن خلايا MeWo ، وهي الخلايا المستهدفة في اختبار الاندماج هذا ، تعبر عن مستقبلات gD (وسيط دخول فيروس الهربس المشفر بواسطة جين TNFRSF14) و syncytin-1 (ASCT2 المشفر بواسطة جين SLC1A5) [33]. زاد Pimecrolimus بشكل كبير من الاندماج الناجم عن كل من HSV-1 المركب fusogenic و syncytin-1 مقارنةً بالتحكم في مركبة DMSO (الشكل 2G). كما هو متوقع ، لم يؤثر sirolimus على الاندماج. تشير هذه النتيجة إلى أن نشاط الفوسفاتيز في الكالسينيورين هو جزء من آلية تنظيم اندماج الخلية المضيفة ، بغض النظر عما إذا كان اندماج الخلية ناتجًا عن اندماج فيروسي أو مضيف. بدون نشاط الفوسفاتيز ، فإن تنظيم الكالسينيورين لقدرة هذه المركبات على تعديل الحاجز الجوهري ضد اندماج الخلية يكون ضعيفًا.

يتطلب اضطراب Pimecrolimus للتنظيم المعتمد على الكالسينيورين للانصهار gB / gH-gL FKBP1A

نظرًا لأن pimecrolimus يربط FKBP1A بترحيل تأثيره المثبط على الكالسينيورين ، فقد تم إجراء ضربة قاضية لـ FKBP1A في خلايا MeWo لتحديد ما إذا كان التأثير المعزز لـ pimecrolimus على VZV gB / gH-gL تم تخفيف اندماج الخلية بوساطة. تم التحقق من صحة ضربة قاضية FKBP1A في كل من مستويات mRNA (انخفاض بنسبة 83.5 ٪) والبروتين (انخفاض بنسبة 86.9 ٪) في خط خلية MeWo-DSP1 مستقر يعبر عن shRNA الخاص بـ FKBP1A ، مقارنة بخلايا التحكم MeWo-DSP1 (الشكل 3A). تم اختبار تأثير ضربة قاضية FKBP1A على تثبيط نشاط فوسفاتيز الكالسينورين بواسطة pimecrolimus باستخدام اختبار النقل النووي NFATC1. في الأساس ، في كل من خلايا التحكم و FKBP1A ضربة قاضية MeWo-DSP1 ، كان لدى 5 ٪ من الخلايا الإيجابية GFP-NFATC1 توطين نووي NFATC1 ، و 60 ٪ كان لديهم تعبير حشوي ونووي منتشر و 35 ٪ لديهم تعبير حشوي فقط. استجاب كلا الخطين الخلويين بشكل مشابه لتنشيط الكالسينورين الناجم عن الأيونوميسين ، مع حدوث إزفاء نووي GFP-NFATC1 في 70 ٪ من الخلايا. أنتجت المعالجة المسبقة لخلايا ضربة قاضية FKBP1A مع pimecrolimus قبل الأيونوميسين زيادة بمقدار 7 أضعاف في الانتقال النووي لـ GFP-NFATC1 وانخفاض بمقدار 3 أضعاف في GFP-NFATC1 السيتوبلازمي مقارنة بخلايا التحكم (الشكل 3 ب). أثبت هذا أن تثبيط نشاط فوسفاتيز الكالسينيورين بواسطة pimecrolimus يعتمد بشكل أساسي على تفاعله مع FKBP1A في خلايا MeWo. ضربة قاضية لـ FKBP1A خفضت بشكل طفيف انصهار الخلية بوساطة gB / gH-gL ولكنها لم تختلف اختلافًا كبيرًا عند مقارنتها بخلايا التحكم MeWo-DSP1 (الشكل 3C). كما هو متوقع ، بينما زاد pimecrolimus بشكل كبير من الانصهار بوساطة gB / gH-gL باستخدام خلايا التحكم MeWo-DSP1 مقارنة بـ DMSO ، فشل الدواء في إحداث زيادة كبيرة في الاندماج باستخدام خلايا MeWo-DSP1 ضربة قاضية FKBP1A (الشكل 3D). أكدت هذه النتائج بيانات النقل النووي NFATC1 ، مما يشير إلى أن FKBP1A كان البروتين الخلوي المحدد المرتبط بـ pimecrolimus لإنتاج التأثير المثبط على الكالسينيورين وأكدت أن عدم انتظام اندماج الخلايا VZV gB / gH-gL بوساطة pimecrolimus كان عن طريق تثبيط فوسفاتاز الكالسينورين. نشاط.

10.1371 / journal.ppat.1009022.g003 الشكل 3 اضطراب Pimecrolimus للتنظيم المعتمد على الكالسينيورين للانصهار gB / gH-gL يتطلب FKBP1A.

(أ) ضربة قاضية FKBP1A shRNA (KD) في خلايا MeWo. تم تطبيع مستويات نسخة FKBP1A المكتشفة بواسطة RT-qPCR في خلايا التحكم MeWo-DSP1 أو خلايا FKBP1A KD MeWo-DSP1 لجين التدبير المنزلي PGM1 وتم تقديمها كنسبة مئوية من خلايا التحكم ، بمتوسط ​​± SEM من ثلاث تجارب مستقلة (ثنائية الذيل ، غير مقترنة اختبار t ، **** ، p & lt 0.0001). لطخة غربية من بروتين FKBP1A (مضاد لـ FKBP1A). تم تطبيع كثافة نطاق FKBP1A إلى خلايا α-tubulin في التحكم وخلايا FKBP1A KD على التوالي. تم تقديم نسبة القيمتين كنسبة مئوية من خلايا التحكم. يتم عرض صورة تمثيلية ، ويعني ± SEM للنسبة من ثلاث تجارب مستقلة. (ب) القياس الكمي لنشاط فوسفاتيز الكالسينيورين في خلايا KD FKBP1A باستخدام مقايسة الانتقال النووي NFATC1. لم تتم معالجة خلايا التحكم MeWo-DSP1 أو خلايا FKBP1A KD MeWo-DSP1 التي تعبر بشكل عابر عن GFP-NFATC1 (متوسطة) أو تمت معالجتها باستخدام DMSO أو pimecrolimus (Pim ، 10 ميكرومتر) قبل 30 دقيقة من أيونوميسين (أيونو ، 1 ميكرومتر 30 دقيقة). صور مجهرية مضان لـ GFP-NFATC1 (أخضر) ، نوى ملطخة بـ Hoechst 33342 (أزرق) ، وصورة مركبة. أشرطة المقياس = 15 ميكرومتر. تشير رؤوس الأسهم الحمراء إلى توطين النواة (N) ، ويشير رأس السهم الأبيض إلى توطين منتشر في كل من النواة والسيتوبلازم (N / C) ، وتشير الأسهم البيضاء إلى توطين السيتوبلازم (C). مؤامرات صندوق وشارب للخلايا الإيجابية GFP-NFATC1. النسبة المئوية للخلايا الإيجابية لـ GFP في التحكم وخلايا FKBP1A KD مع توطين GFP-NAFTC1 إلى N و N / C و C. تمثل الصناديق 25-75 في المائة ، وتمتد الشعيرات إلى 10-90 في المائة ، والوسيط هو النطاق الأفقي ، و متوسط ​​الخلايا (+) (ن = 15 مجال رؤية ، 13-22 خلية لكل مجال رؤية) من تجربتين مستقلتين. النقاط هي القيم المتطرفة. تم تحليل الفرق الإحصائي بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه لكل حالة علاجية (غير المعالجة ، DMSO + Iono ، و Pim + Iono) مقارنةً بتلك الموجودة في خلايا التحكم ، ويتم عرض أزواج مختلفة بشكل كبير (**** ، p & lt 0.0001). (C و D) تأثير FKBP1A KD على الاندماج بوساطة VZV gB / gH-gL والاستجابة لـ pimecrolimus. مخططات الصندوق والشعيرات للانصهار الخلوي التي تم تحديدها كميًا بواسطة SRFA في خلايا التحكم MeWo-DSP1 أو خلايا FKBP1A KD MeWo-DSP1 المنقولة بالبلازميدات للتعبير عن VZV gB / gH [TL] -gL وزرعها بشكل مشترك مع خلايا MeWo-DSP2 ، غير المعالجة ( متوسط ​​Med) أو معالج بـ DMSO أو pimecrolimus (Pim ، 10 ميكرومتر) لمدة 48 ساعة. تمت مقارنة كفاءة اندماج الخلايا عند عدم المعالجة بين خلايا FKBP1A KD وخلايا التحكم ، كما هو موضح كنسبة مئوية من خلايا التحكم (C) ، وتم تقييم الاستجابة لـ pimecrolimus عن طريق التطبيع إلى الوسط غير المعالج (٪ وسط) لكل عنصر تحكم وخط خلية FKBP1A KD على التوالي (د). تمثل الصناديق 25-75 مئويًا ، وتمتد الشعيرات إلى 10-90 مئويًا ، والوسيط هو النطاق الأفقي ، والمتوسط ​​(+) من ثلاث تجارب مستقلة. النقاط هي القيم المتطرفة. تم تقييم الفروق الإحصائية عن طريق اختبار مان-ويتني غير المتزاوج (C) (ns ، ليس مهمًا) أو ANOVA ثنائي الاتجاه (D) (ns ، غير مهم **** ، p & lt 0.0001).

يدعم Calcineurin اندماج الخلايا بوساطة VZV gB / gH-gL

Calcineurin هو مغاير مغاير يتألف من الوحدة الفرعية التحفيزية A (CNA) والوحدة الفرعية التنظيمية B (CNB). إن ارتباط CNB بـ CNA مطلوب لتفعيل الكالسينيورين لتمكين وظيفة الفوسفاتيز [47 ، 48]. نظرًا لأن CNB1 هو الشكل الإسوي الوحيد لـ CNB المعبر عنه في خلايا MeWo [33] ، فقد تم التخلص من CNB1 بواسطة shRNA لتقييم تأثيرات الكالسينيورين مباشرةً على اندماج الخلية بوساطة VZV gB / gH-gL. قلل CNB1 shRNA بشكل معتدل من مستويات الرنا المرسال (انخفاض بنسبة 77.0 ٪) والبروتين (انخفاض بنسبة 42.3 ٪) من CNB1 (الشكل 4 أ). تم تقليل الاندماج الناجم عن VZV gB / gH-gL بشكل كبير في خلايا CNB1 ضربة قاضية MeWo-DSP1 ، إلى 39.7 ٪ فقط من خلايا التحكم MeWo-DSP1 (الشكل 4 ب) ، مما يشير إلى أن مغاير الكالسينورين السليم مهم لـ VZV gB / gH- gL لتنفيذ الاندماج. Pimecrolimus محسّن الانصهار في خلايا MeWo-DSP1 بضربة قاضية CNB1 عند مقارنتها بـ DMSO ، لكن مستوى الزيادة كان أقل بكثير مقارنة بالمستوى الذي لوحظ في خلايا التحكم MeWo-DSP1 (الشكل 4C). من المحتمل أن يكون الكشف عن الانصهار المعزز المتبقي بواسطة pimecrolimus بسبب الضربة القاضية غير الكاملة لـ CNB1 mRNA والانخفاض المحدود في إنتاج البروتين.

10.1371 / journal.ppat.1009022.g004 الشكل 4 يدعم Calcineurin اندماج الخلايا بوساطة VZV gB / gH-gL.

(أ) ضربة قاضية CNB1 shRNA (KD) في خلايا MeWo. تم تطبيع مستويات نص CNB1 في خلايا التحكم MeWo-DSP1 أو خلايا CNB1 KD MeWo-DSP1 التي اكتشفها RT-qPCR إلى جين التدبير المنزلي PGM1 وتم تقديمها كنسبة مئوية من خلايا التحكم ، مع متوسط ​​± SEM من تجربتين مستقلتين (ثنائي الذيل ، غير مزدوج) اختبار t ، **** ، P & lt 0.0001). لطخة غربية من بروتين CNB1 (مضاد لـ CNB1). تم تطبيع كثافة شريط CNB1 إلى خلايا α-tubulin في التحكم وخلايا CNB1 KD على التوالي. تم تقديم نسبة القيمتين كنسبة مئوية من خلايا التحكم. يتم عرض صورة تمثيلية ، ويعني ± SEM للنسبة من تجربتين مستقلتين. (B و C) تأثير CNB1 KD على الاندماج بوساطة VZV gB / gH-gL والاستجابة لـ pimecrolimus. مخططات الصندوق والشعيرات للانصهار الخلوي التي تم تحديدها كميًا بواسطة SRFA في خلايا التحكم MeWo-DSP1 أو خلايا CNB1 KD MeWo-DSP1 المنقولة بالبلازميدات للتعبير عن VZV gB / gH [TL] -gL وزرعها بشكل مشترك مع خلايا MeWo-DSP2 ، غير المعالجة ( متوسط ​​Med) أو معالج بـ DMSO أو pimecrolimus (Pim ، 10 ميكرومتر) لمدة 48 ساعة. تمت مقارنة كفاءة اندماج الخلايا عند عدم المعالجة بين خلايا CNB1 KD وخلايا التحكم ، كما هو موضح كنسبة مئوية من خلايا التحكم (B) ، وتم تقييم الاستجابة لـ pimecrolimus بالتطبيع إلى غير المعالج (٪ وسط) لكل عنصر تحكم و CNB1 KD خط الخلية على التوالي (ج). تمثل الصناديق 25-75 في المائة ، والشعيرات تمتد إلى 10-90 في المائة ، والوسيط هو النطاق الأفقي ، والمتوسط ​​(+) من تجربتين مستقلتين. تم تقييم الفروق الإحصائية عن طريق اختبار مان-ويتني غير المتزاوج (B) (** ، p & lt 0.01) أو ANOVA ثنائي الاتجاه (C) (ns ، غير مهم * ، p & lt 0.05 **** ، p & lt 0.0001) .

تم الحفاظ على نشاط فوسفاتيز الكالسينورين في الخلايا المصابة بفيروس VZV

لتقييم أهمية نشاط الكالسينيورين لعدوى VZV ، تم إجراء فحوصات الانتقال النووي NFATC1 باستخدام خلايا MeWo التي تعبر بشكل عابر عن GFP-NFATC1 التي أصيبت بمؤتلف VZV يعبر عن طلب تقديم العروض (pOka-TK-RFP) (الشكل 5A). بدون علاج الأيونوميسين ، تم توطين 88 ٪ من GFP-NFATC1 في العصارة الخلوية للخلايا المصابة بفيروس VZV ، بينما تسبب علاج الأيونوميسين في انتقال 94 ٪ من GFP-NFATC1 إلى نوى الخلايا المصابة (الشكل 5 ب) ، مما يشير إلى أن فوسفاتيز الكالسينيورين كان الاحتفاظ بها أثناء العدوى. الأهم من ذلك ، نجحت المعالجة المسبقة لـ pimecrolimus في منع الانتقال النووي الناجم عن الأيونوميسين لـ GFP-NFATC1 (الشكل 5B) ، مما يؤكد أن pimecrolimus يثبط نشاط فوسفاتاز الكالسينيورين مباشرة في الخلايا المصابة بـ VZV.

10.1371 / journal.ppat.1009022.g005 الشكل 5 يظل نشاط فوسفاتيز الكالسينيورين وظيفيًا في الخلايا المصابة بفيروس VZV.

(أ) صور مجهرية مضان لخلايا MeWo تعبر بشكل عابر عن GFP-NFATC1 بسرعة 16 نقطة في البوصة باستخدام pOka-TK-RFP التي لم تتم معالجتها (متوسطة) أو تمت معالجتها باستخدام DMSO أو pimecrolimus (Pim ، 10 ميكرومتر) 30 دقيقة قبل تحفيز الأيونوميسين (Iono ، 1 ميكرومتر 30 دقيقة) pOka-TK-RFP (أحمر) و GFP-NFATC1 (أخضر) ونواة ملطخة بـ Hoechst 33342 (أزرق) وصورة مركبة. أشرطة المقياس = 15 ميكرومتر. (ب) المؤامرات مربع وطويل من GFP-NFATC1 توطين في الخلايا المصابة VZV. من إجمالي الخلايا التي تعبر عن GFP-NFATC1 والتي أصيبت أيضًا بـ TK-RFP ، النسبة المئوية للخلايا مع GFP-NAFTC1 المنقولة إلى نواة (N) ، منتشرة في النواة والعصارة الخلوية (N / C) ، أو مترجمة في العصارة الخلوية (C) . تمثل المربعات 25-75 مئويًا ، وتمتد الشعيرات إلى 10-90 مئويًا ، والوسيط هو النطاق الأفقي ، والمتوسط ​​(+) للخلايا (ن = 12 حقلاً للعرض ، 41-66 خلية لكل مجال رؤية) من ثلاثة مستقلة تجربة. النقاط هي القيم المتطرفة. تم تحليل الفرق الإحصائي بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه لكل مجموعة توطين (N ، N / C ، و C) مقارنة بتلك الموجودة في غير المعالجة ، كما هو موضح في الأزواج المختلفة بشكل كبير (**** ، p & lt 0.0001).

عزز تثبيط نشاط فوسفاتيز الكالسينيورين من اندماج الخلايا ولكنه أدى إلى كبت انتشار VZV

لتحديد ما إذا كان نشاط فوسفاتيز الكالسينيورين ضروريًا لتنظيم اندماج الخلية أثناء تكرار VZV ، تم تحديد عدد النوى الموجودة داخل المخلوقات الخلوية لخلايا Life-Act-tGFP MeWo المصابة بـ pOka-TK-RFP استجابةً للعلاج باستخدام pimecrolimus أو عنصر تحكم DMSO (الشكل 6 أ). في حين أن التوسع المخلوي كان عبارة عن حركة ديناميكية تتضمن دمج الخلايا التي تم الاتصال بها حديثًا في محيط المخلوط خلال 24 إلى 40 ساعة بعد الإصابة المسجلة (hpi) (أفلام S1 و S2) ، كانت النافذة الزمنية للزيادة الخطية في النوى داخل المخلوقات. بين 24 إلى 30 نقطة في البوصة (الشكل 6 أ و 6 ب). تمت زيادة الاندماج في الخلايا المعالجة بـ pimecrolimus ، مما أدى إلى زيادة عدد النوى بشكل ملحوظ داخل المخلوط مقارنةً بالتحكم في DMSO بين 24 إلى 30 حصانًا في البوصة (الشكل 6C). أكد الاندماج المتزايد للخلايا المصابة بـ VZV عندما تم تثبيط نشاط فوسفاتيز الكالسينيورين الملاحظات في gB / gH-gL SRFA في غياب بروتينات VZV الأخرى. بشكل حاسم ، أظهرت هذه البيانات أن الدور التنظيمي للكالسينورين في الاندماج بوساطة VZV gB / gH-gL لم يكن بسبب استخدام gH [TL] في SRFA.

10.1371 / journal.ppat.1009022.g006 الشكل 6 اندماج الخلايا المحسن الناجم عن تثبيط نشاط فوسفاتيز الكالسينيورين أثناء الإصابة بفيروس VZV.

(أ) الفحص المجهري متحد البؤر لخلايا LifeAct-tGFP MeWo المصابة بـ pOka-TK-RFP ، والمعالجة بـ DMSO أو pimecrolimus (Pim 10 ميكرومتر). لويحات تمثيلية تم التقاطها من الفحص المجهري للخلايا الحية بمعدل 24 و 30 نقطة في البوصة من أفلام S1 و S2 ، والتي تُظهر الخلايا المصابة بـ pOka-TK-RFP (باللون الأحمر) وخيوط الأكتين المسمى LifeAct-tGFP (باللون الأخضر) والنواة الملطخة بـ Hoechst 33342 ( أزرق). أشرطة مقياس = 100 ميكرومتر. (ب) تواتر النوى في المخلوقات على فترات 40 دقيقة من 24 إلى 30 نقطة في البوصة للوحات في (أ). تم حساب معامل التحديد (R 2) لتحديد العلاقة الخطية لزيادة تواتر النوى في المخلوط خلال نافذة 6 ساعات من الإصابة. (C) قطع النقاط المبعثرة لزيادة تردد النوى في المخلوقات من 24 إلى 30 نقطة في البوصة. يعني ± SEM للوحات (ن = 8) من تجربتين مجهريتين مستقلتين للخلايا الحية. تم تقييم الدلالة الإحصائية من خلال اختبار مان-ويتني غير المتزاوج وغير المعلمي (* ، p & lt 0.05).

أظهرت الدراسات السابقة أن اندماج الخلايا غير المنتظم بسبب التحكم المعطل بواسطة CTDs لـ gB و gH يؤدي إلى ضعف في إمراض الجلد ويؤدي إلى انتشار ضعيف لـ VZV ، وهو ما يتضح من انخفاض أحجام البلاك والاختراق المحدود في طبقة خلية MeWo أحادية الطبقة عند هوامش البلاك [18 ، 25 ، 26]. لتحديد ما إذا كان اندماج الخلايا المعزز استجابة للتداخل مع تنظيم الكالسينيورين له عواقب مماثلة ، تم علاج خلايا MeWo المصابة بفيروس VZV باستخدام pimecrolimus. بالنسبة إلى لويحات الطفرات مفرطة التولد gB [Y881F] و gH [TL] [18 ، 25] ، فإن لويحات VZV pOka لها هامش أضيق مع علاج pimecrolimus في 4 أيام بعد الإصابة (نقطة في البوصة) مقارنة بالخلايا المتوسطة والمعالجة بـ DMSO كما هو متصور عن طريق الكيمياء المناعية (IHC) (الشكل 7 أ). تم أيضًا تقليل أحجام البلاك من pOka بشكل كبير بواسطة pimecrolimus (0.68 ± 0.32 مم 2) مقارنةً بأحجام الوسط (1.34 ± 0.49 مم 2) أو DMSO (1.21 ± 0.60 مم 2) (الشكل 7 ب). بالإضافة إلى ذلك ، كانت الطبقات الأحادية المعالجة بـ pimecrolimus تحتوي على طبقات دقيقة أكثر تكرارًا ، ويفترض أن يكون ذلك بسبب الانفصال المبكر للخلايا عن مراكز اللويحات الأولية التي لوحظت أيضًا في خلايا MeWo المصابة بـ gB [Y881F] ، ونقل جسيمات VZV المرتبطة بغشاء الخلية شظايا لإنشاء بؤر ثانوية (الشكل 7 د). بينما أدت هذه اللويحات الثانوية إلى ارتفاع تردد اللويحات في الطبقات الأحادية المعالجة بـ pimecrolimus والتكافؤ الواضح لحركية نمو VZV عند 2-4 نقطة في البوصة (الشكلان 7D و S3) ، ظلت المساحة الإجمالية للويحات في الطبقات الأحادية المعالجة pimecrolimus أقل بنسبة 50٪ من تلك التي لوحظت مع علاج متوسط ​​أو DMSO (الشكل 7 د). مجتمعة ، كان تنظيم اندماج الخلايا عن طريق الكالسينورين ضروريًا للانتشار النموذجي لـ VZV في طبقات أحادية الخلية أثناء التكاثر الفيروسي ولم يقتصر على التأثير على انصهار الخلية بوساطة gB / gH-gL في غياب البروتينات الفيروسية الأخرى.

10.1371 / journal.ppat.1009022.g007 الشكل 7 تثبيط نشاط فوسفاتيز الكالسينيورين يمنع انتشار VZV في خلايا MeWo.

أحجام البلاك من VZV pOka في خلايا MeWo غير المعالجة (متوسط ​​متوسط) ، تعامل مع DMSO أو pimecrolimus (Pim 10 ميكرومتر) عند 4 نقطة في البوصة. (أ) تلطيخ الكيمياء المناعية للوحات VZV بمتوسط ​​حجم البلاك لكل حالة. أشرطة المقياس = 0.3 مم. (ب) قطع مربعة وطويلة بأحجام البلاك (مم 2). تظهر المربعات النسبة المئوية 25-75 ، والشعيرات تمتد إلى 10-90 في المائة ، والوسيط هو النطاق الأفقي ، والمتوسط ​​(+) من ثلاث تجارب مستقلة (ن = 60). النقاط هي القيم المتطرفة. تم تقييم الفروق الإحصائية بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه (ns ، ليست مهمة **** ، p & lt 0.0001). (C) مخططات الصندوق والشعيرات لخلايا MeWo أو خلايا التحكم MeWo-DSP1 أو خلايا FKBP1A KD MeWo-DSP1 بدقة 4 نقطة في البوصة مع VZV pOka ، غير المعالجة (متوسط ​​المتوسط) أو المعالجة بـ DMSO أو pimecrolimus (Pim ، 10 ميكرومتر). النسبة المئوية لحجم اللويحة المقيسة إلى غير المعالجة (٪ وسط). تظهر المربعات النسبة المئوية 25-75 ، والشعيرات تمتد إلى 10-90 في المائة ، والوسيط هو النطاق الأفقي ، والمتوسط ​​(+) من تجربتين مستقلتين (ن = 60). النقاط هي القيم المتطرفة. تم تقييم الفروق الإحصائية بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه (ns ، ليس هامًا **** ، p & lt 0.0001). (د) التردد والمساحة الإجمالية للويحات في وجود pimecrolimus. لم يتم معالجة خلايا MeWo المصابة بـ pOka (وسط) ، وعولجت بـ DMSO أو pimecrolimus (10 ميكرومتر) لمدة 4 أيام ، وتم تحليل تردد البلاك ومساحة البلاك الكلية عن طريق حساب الجسيمات التلقائي ImageJ. يتم عرض النتيجة التمثيلية من 3 تجارب مستقلة ، مع إدخال صور الكيمياء المناعية (أشرطة مقياس = 2 مم) ، الصور المعالجة والقياسات المدرجة.

تم تأكيد دور نشاط فوسفاتيز الكالسينيورين في الانتشار الفيروسي عن طريق قياس أحجام البلاك في خلايا MeWo-DSP1 المصابة بـ VZV (الشكل 7C). كما هو متوقع ، قلل علاج pimecrolimus متوسط ​​حجم البلاك إلى 50 ٪ من ذلك باستخدام عناصر تحكم متوسطة أو DMSO في كل من خلايا MeWo وخلايا التحكم MeWo-DSP1. في المقابل ، لم تنخفض أحجام البلاك بشكل كبير في خلايا MeWo-DSP1 التي تم علاجها باستخدام pimecrolimus مقارنةً بعناصر التحكم المتوسطة و DMSO ، مما يشير إلى أن الاندماج المبالغ فيه بسبب تثبيط نشاط فوسفاتيز الكالسينورين كان العامل الأساسي في انتشار VZV الضعيف.

كشفت البروتينات الفوسفورية لخلايا MeWo المعالجة بـ pimecrolimus عن ركائز جديدة محتملة لمضيف الكالسينيورين

من المعروف أن Calcineurin انتقائي للغاية لأهداف إزالة الفسفرة من خلال التعرف على اثنين من أشكال الالتحام القصيرة على ركائزه ، PxIxIT و LxVP [49 ، 50]. تم اشتقاق تسلسل الإجماع الخاص بزخارف PxIxIT و LxVP من 20 ركيزة تم تحديدها مسبقًا من الكالسينيورين (الشكل 8 أ وجدول S3). يحتوي نموذج PxIxIT على قيود البرولين في الموضع 1 ولا يتسامح إلا مع البدائل المحافظة بأحماض أمينية كارهة للماء في الموضعين 3 و 5 ، بينما الموضع 6 أكثر تدهورًا ، ويقبل كل من المخلفات المحبة للماء والكارهة للماء. وبالمثل ، فإن عزر LxVP له قيود على البرولين في الموضع 4 ولكنه يتسامح مع البدائل المحافظة بأحماض أمينية كارهة للماء في الموضع 1 و 3 (الشكل 8 أ).

10.1371 / journal.ppat.1009022.g008 الشكل 8 تثبيط نشاط فوسفاتيز الكالسينيورين يغير البروتينات الفوسفاتية لخلايا MeWo.

(أ) توافق الزخارف لرسو السفن على ركائز الكالسينيورين لربط الكالسينيورين. تم استخدام أشكال PxIxIT و LxVP من 20 ركيزة تم التحقق منها مسبقًا من الكالسينيورين لتوليد فكرة الإجماع بواسطة WebLogo 3. يتم تمثيل تردد الأحماض الأمينية في كل موضع بارتفاع الحرف. تتمثل الخصائص الكيميائية للأحماض الأمينية في لون الحرف: أخضر ، أرجواني قطبي ، أزرق محايد ، أحمر أساسي ، أسود حمضي ، كاره للماء. (ب) خريطة حرارية للبروتينات الفسفورية الفريدة المكتشفة في خلايا MeWo المعالجة بـ pimecrolimus (10 ميكرومتر) لمدة ساعتين. تم استخلاص البروتينات الخلوية الكلية في وجود مثبطات الفوسفاتيز وتخضع لإثراء الفوسفوببتيد Zr-IMAC ، متبوعًا بمقياس الطيف الكتلي orbitrap. تم تحليل ثلاث عينات بيولوجية لكل حالة ويتم عرض الأطياف النسبية للبروتينات الفسفورية الفريدة التي تم اكتشافها في جميع العينات الثلاثة المعالجة بـ pimecrolimus ولكن ليس في عينات DMSO في خريطة الحرارة. العامل النووي للخلايا التائية المنشطة 1 (NFATC1) عامل نسخ ETS (ELK1) الفوسفاتاز ومنظم الأكتين 2 (PHACTR2) عامل ربط مُحسِّن الإنترلوكين 3 (ILF3) مُحفِّز مستقبل نووي 1 (NCOA1) بروتين شبيه بقناة الغشاء 8 (TMC8) ميثيل -CpG بروتين مجال ربط 1 (MBD1). ركائز الكالسينيورين المعروفة سابقًا مميزة بعلامات النجمة (*). (ج) عزر الالتحام المحتمل لربط الكالسينورين على البروتينات الفسفورية التي تم تحديدها حديثًا والموجودة بواسطة محاذاة كلوستال باستخدام عزر الإجماع. الأحماض الأمينية المحفوظة على شكل PxIxIT و LxVP (أحمر) ، بدائل محافظة (زرقاء) ، نموذج الالتحام على ركائز معروفة سابقًا من الكالسينيورين (محاصر).

لذلك ، كخطوة أولى نحو تحديد العناصر النهائية المحتملة المشاركة في تنظيم الاندماج ، تم فحص ركائز المضيف باستخدام تخصيب الفوسفوببتيد ومطياف الكتلة Orbitrap لتحديد البروتينات التي تم فسفرتها حصريًا عندما عولجت خلايا MeWo مع pimecrolimus مقارنة بالخلايا المعالجة بـ DMSO. من بين 5177 بروتين فوسفوري تم اكتشافه ، سبعة فقط تم فسفرتها حصريًا في مواقع سيرين أو ثريونين في pimecrolimus المعالجة ولكن ليس في خلايا MeWo المعالجة بـ DMSO. اثنان من السبعة كانوا NFATC1 و ELK1 ، وهما أهداف معروفة لإزالة فسفرة الكالسينيورين [50 ، 51] (الشكل 8 ب وجدول S2). وبالتالي ، فإن استمرار NFATC1 و ELK1 الفسفوري كان بمثابة ضوابط لبيانات البروتين الفسفوري من خلايا MeWo المعالجة بـ pimecrolimus. الأهم من ذلك ، وعلى حد علمنا ، أنه لم يتم الإبلاغ سابقًا عن أي من البروتينات الخمسة المتبقية ، PHACTR2 و ILF3 و NCOA1 و TMC8 و MBD1 ، التي ظلت فسفرة في وجود pimecrolimus كركائز لـ calcineurin. احتوت جميع البروتينات الفسفورية الأربعة و PHACTR2 و ILF3 و NCOA1 و TMC8 على أشكال الإرساء الإجماعية PxIxIT و LxVP ، مع بدائل متحفظة في المواضع 3 و 5 على PxIxIT ، والمواضع 1 و 3 على LxVP ، مما يشير إلى أنها من المحتمل أن تكون ركائز الكالسينيورين المباشرة (الشكل 8 ج). ومع ذلك ، افتقر MBD1 إلى بديل متحفظ في الموضع 3 على عزر PxIxIT ، مما قد يضعف إرساء الكالسينيورين (الشكل 8C). إذا كان الأمر كذلك ، فقد تكون فسفرة MBD1 بشكل غير مباشر بسبب تثبيط الكالسينيورين. مجتمعة ، يؤدي تثبيط نشاط فوسفاتيز الكالسينيورين إلى فسفرة فريدة لهذه البروتينات السبعة المضيفة وانصهار الخلايا الذي يسببه VZV بشكل مبالغ فيه. ما هو الدور الذي يلعبه نزع الفسفرة لواحد أو أكثر من هذه البروتينات في تنظيم الكالسينيورين لانصهار خلايا VZV غير معروف ولكن الدراسة الحالية توفر الأساس لمزيد من التحقيقات.

السمة المميزة للإمراض VZV هي قدرته على التغلب على الحواجز الجوهرية أمام اندماج الخلايا التي يسببها مجمع gB / gH-gL. استخدمت الدراسة الحالية HT-SRFA لتحديد عامل مضيف الخلية الحرج ، كالسينيورين ، المطلوب للانصهار الخلوي المتعارف عليه VZV. لقد أثبتنا أن كلا من tacrolimus و pimecrolimus ، مثبطات الكالسينيورين المعروفة ، تعمل عن طريق تكوين مركب بروتين دوائي مع FKBP1A الذي يمنع الكالسينورين من العمل كفوسفاتيز خلوي. على عكس tacrolimus و pimecrolimus ، فإن sirolimus ، وهو دواء يشكل أيضًا مركبًا مع FKBP1A ولكنه يثبط mTOR بدلاً من الكالسينيورين ، فشل في منع تنشيط الكالسينورين الناجم عن أيونوميسين ولم يؤثر على اندماج الخلايا الناجم عن أي من VZV gB / gH-gL ، HSV -1 غيغابايت / غ-غل / غد ، أو سينسيتين -1. يميز هذا الاكتشاف بين التأثيرين التاليين اللذين ينجم عن ارتباط هذه الأدوية بـ FKBP1A ويدعم بقوة أن نشاط فوسفاتاز الكالسينيورين أمر بالغ الأهمية لتنظيم اندماج الخلايا الناجم عن VZV gB / gH-gL وهذه المركبات fusogens الأخرى.

باعتباره فيروسًا شديد الارتباط بالخلايا ، يطلق فيروس VZV عددًا قليلاً جدًا من جزيئات الفيروس المعدية في البيئة خارج الخلية [52]. وبالتالي ، فإن اندماج الخلايا المعطل يؤثر على انتشار VZV أكثر مما يؤثر على فيروسات الهربس الألفي الأخرى ، مثل HSV-1 ، الذي ينتج أوامر أكبر من الفيروسات الخالية من الخلايا ، حتى في سياق الأنماط الظاهرية المخلوية [53 - 56]. أظهرت دراساتنا السابقة أن المستوى الأساسي من اندماج الخلية مطلوب لانتشار فيروس VZV حيث أن طفرات في مجال gB أو gH الخارجي التي تعطل اندماج الخلية يمكن أن تسبب ضعفًا شديدًا في النسخ المتماثل أو تعطل VZV ، مما يسمح بانتشار الفيروس بشكل ضئيل أو معدوم [18 ، 21 ، 22 ]. ومع ذلك ، فإن الفشل في التحكم في عملية اندماج الخلايا التي يسببها الفيروس يقلل أيضًا بشكل ملحوظ من انتشار الفيروس حيث أن الطفرات في gB أو gH CTD التي تعزز الاندماج تكبح في الواقع انتشار الفيروس بسبب إعاقة تجميع جزيئات الفيروس [18 ، 25]. والجدير بالذكر أن الاندماج الخلوي المبالغ فيه يضعف أيضًا عدوى VZV في طعوم الجلد [18 ، 25]. لذلك ، على عكس فيروسات الهربس الألفي الأخرى التي تنتج كميات كبيرة من الفيروسات خارج الخلية ، فإن اندماج الخلايا الناجم عن VZV يحتاج إلى تنظيم صارم للسماح بانتشار الفيروس من أجل التسبب في المرض. تربط الدراسة الحالية نشاط فوسفاتيز الكالسينيورين بهذه اللائحة.

باعتباره أحد البروتينات الرئيسية في شبكات إشارات الكالسيوم ، يشارك الكالسينيورين على نطاق واسع في التعبير الجيني للخلية المضيفة ، والاتجار بالأغشية ، وترتيب الهيكل الخلوي ، ودورة الخلية ، والاستماتة [57]. في هذا السياق ، تم تورط الكالسينيورين على وجه التحديد في اندماج الخلايا العضلية المطلوبة لتمايز العضلات والهيكل العظمي ونموها التي تظهر من خلال عواقب تثبيط وظيفتها [58 ، 59]. علاوة على ذلك ، ينظم الكالسينيورين اندماج الخلايا اللازم لتكوين العظام حيث أن تثبيطه بواسطة تاكروليموس يقلل من تكوين ناقضات العظم المتمايزة متعددة النوى [60 ، 61]. بينما تساهم عوامل خلوية أخرى في التحكم في اندماج الخلايا الخلوية المستحث بالفيروس ، على سبيل المثال ، IFITM و tetraspanin و Ezrin و EWI-2 ، والتي ثبت أنها تمنع تخليق الخلايا التائية الناجم عن فيروس نقص المناعة البشرية [62 - 66] ، على حد علمنا ، كالسينيورين لم يتم الإبلاغ عن تنظيم اندماج الخلايا الناجم عن أي من الفيروسات المسببة للاندماج. إن اكتشاف أن تثبيط نشاط فوسفاتيز الكالسينيورين عزز أيضًا اندماج الخلايا الناجم عن HSV-1 gB / gH-gL / gD يسلط الضوء على أن الكالسينورين له دور عام في تنظيم الاندماج الفيروسي. يستخدم VZV نشاط الفوسفاتيز لبروتين الخلية المضيفة هذا بالإضافة إلى التنظيم الفيروسي المباشر بواسطة العناصر الوظيفية في gB و gH CTDs لمنع اندماج الخلايا المبالغ فيه يعكس توازنًا متطورًا جيدًا ضروريًا لتجميع ذرية الذرية ، والذي يتم تعطيله عندما لا يكون الاندماج منظمة بشكل فعال.

في استكشاف أولي لركائز الكالسينيورين المحتملة التي قد تكون متورطة في وظيفة تنظيم الاندماج ، حددت الدراسة الحالية سبعة بروتينات فسفورية مضيفة ظلت فسفرة عندما تم تثبيط نشاط فوسفاتيز الكالسينيورين بواسطة pimecrolimus (جدول S2). تم اكتشاف نسخ mRNA لهذه البروتينات الخمسة (PHACTR2 و ILF3 و NCOA1 و TMC8 و MBD1) بالإضافة إلى ركيزتي الكالسينيورين المعروفين (NFATC1 و ELK1) في الخلايا المصابة بفيروس VZV بمستويات مماثلة للخلايا غير المصابة [33]. من بين هؤلاء ، المنشط المساعد للمستقبل النووي 1 (NCOA1) ، وهو عضو في عائلة منشط الستيرويد / المستقبل النووي ، مهم لأن تفاعله يتضمن مستقبلات هرمون الاستروجين (ER) ، مستقبلات حمض الريتينويك (RAR) ومستقبلات ريتينويد X RXR (RXR). ) [67 - 70]. حدد HT-SRFA ثلاثة مركبات هي مضادات مستقبلات هرمون الاستروجين ومركبين هما يجند مستقبلات حمض الريتينويك أو منبهات مستقبلات حمض الريتينويك ، وكلها تعزز اندماج الخلايا (جدول S1). يعتمد التفاعل بين NCOA1 و ER أو RAR أو RXR بشكل أساسي على نموذج LxxLL الموجود في مجال تفاعل المستقبلات النووية على NCOA1 [71]. يقع Ser-369 في منطقة غنية بسيرين / ثريونين من NCOA1 ، بينما Ser-698 عبارة عن أربعة أحماض أمينية في اتجاه مجرى الشكل الرابع LxxLL على NCOA1 ، مما قد يؤثر على تكوين NCOA1 بطريقة تغير إمكانية الوصول إلى المستقبل النووي [ 72]. من المتوقع أن يكون للفسفرة في هذه المواقع بسبب تثبيط الكالسينيورين (جدول S2) تأثير مماثل على الاندماج كما لوحظ مع الأدوية المحددة بواسطة HT-SRFA التي تستهدف المستقبلات النووية مباشرة. يعد PHACTR2 أيضًا ذا أهمية خاصة لأن أعضاء عائلة الفوسفاتيز والمنظمين الأكتين (PHACTR1-4) معروفون بدورهم في تعديل بنية الهيكل الخلوي [73]. يرتبط G-actin أحادي بـ PHACTR4 عندما ينخفض ​​مستوى G-actin الأحادي ، يستشعر PHACTR4 التغيير ويعزز إزالة بلمرة خيوط الأكتين لتجديد تجمع G-actin الأحادي [74]. لم يتم دراسة PHACTR2 إلا أنه قد ينظم ديناميكيات الأكتين بطريقة مماثلة لأن جميع بروتينات PHACTR تشترك في تشابه التسلسل في مجالات ربط G-actin [73]. تم اكتشاف Ser-510 على PHACTR2 لأول مرة ليتم فسفرته استجابةً لتثبيط الكالسينيورين (جدول S2) ، ويمكن تعيينه للمنطقة القريبة من حيث يرتبط G-actin. قد تعيق الفسفرة في هذا الموقع التفاعل بين PHACTR2 و G-actin ، مما يؤدي إلى إزالة بلمرة الأكتين. هذا يمكن أن يحفز اندماج الخلية بالنظر إلى أنه تم الإبلاغ عن أن قشرة الأكتين تتحكم في تكوين المخلوط عن طريق تثبيط توسيع مسام الاندماج [75] ، ويتوافق مع اندماج خلية VZV المحسن الناجم في غياب نشاط فوسفاتاز الكالسينيورين.

بالإضافة إلى VZV ، فإن اندماج الخلايا هو أيضًا أحد مكونات التسبب في فيروس HSV ، ويتضح من الخلايا متعددة النوى التي لوحظت في أنسجة الجلد المصابة [2]. من المثير للاهتمام ، ربطت دراسة حديثة بين بروتين تيروزين فوسفاتيز 1B (PTP1B) و HSV-1 اندماج الخلايا الخلوية المستحثة من خلال الملاحظات باستخدام مركب ملحي يعزز الاندماج [76].ومع ذلك ، على النقيض من اندماج الخلايا المعتمد على VZV gB / gH-gL المعزز بسبب تثبيط الكالسينورين ، كان الاندماج الناجم عن اللعاب للخلايا المصابة بـ HSV-1 يعتمد على البروتينات الإضافية الفيروسية مثل PTP1B والهدف من salubrinal لم ينظم الاندماج الأساسي الآلات في عزلة ولكن فقط عندما تكون في مجمع يحتوي على بروتينات ملحقة. بالإضافة إلى ذلك ، لا تزال الفسفرة المستمرة لـ eIF2α ، وهي استجابة مضيفة راسخة للالابرينال ، تحدث عندما تم إيقاف PTP1B ، مما يشير إلى أن PTP1B لم يكن الهدف المباشر لـ salubrinal ، ومن المحتمل أن يكون تأثير salubrinal على اندماج الخلايا HSV-1 متضمنًا بروتينات إضافية غير معروفة. سلطت هذه الدراسة الضوء على تفاعل متعدد الأوجه بين بروتينات الخلية المضيفة في تنظيم اندماج الخلايا HSV-1.

مما لا يثير الدهشة ، نظرًا للتنظيم متعدد العوامل للبيولوجيا المعقدة للانصهار الخلوي الناجم عن فيروس الهربس ، حددت بيانات HT-SRFA بروتينات الخلايا المضيفة الإضافية التي قد تشارك أيضًا في تنظيم الاندماج بشكل مستقل عن مسار الكالسينورين وتضمن مزيدًا من الدراسة. التنظيم التفاضلي الذي يعتمد على التعبير النوعي لنوع الخلية عن عوامل الخلية المضيفة قد يفسر أيضًا حقيقة أنه بينما يحفز VZV اندماج الخلايا بين خلايا الجلد والعقد الحسية ، فإن الخلايا التائية المصابة بفيروس VZV لا تندمج [77 - 79]. نظرًا لأن اندماج الخلايا الناجم عن VZV أمر محوري للإمراض في المضيف البشري ، فإن العلاجات الموجهة من المضيف والتي تستهدف الاندماج يمكن أن تحسن العلاج المضاد للفيروسات ، وبالتالي ، توفر هذه العوامل فرصًا لتصميم التدخلات ضد مسببات الأمراض الفيروسية الأخرى.

المواد والأساليب الخلايا والفيروسات

خلايا CHO-DSP1 [28] ، مشتقة من خلايا مبيض الهامستر الصيني (CHO) K1 (CCL-61 ، ATCC) التي تعبر عن بروتين انقسام مزدوج (DSP)1-7 من بروتين المراسل الكيمري المكون من GFP المقسم و Renilla luciferase المنفصل ، تم نشره باستخدام وسط خليط المغذيات F-12K (Corning) مع 10 ٪ من مصل بقري جنيني (FBS ، Gibco) ، البنسلين (100 U / ml ، Gibco) ، و الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل ، جيبكو) ، مع اختيار بوروميسين (8 ميكروغرام / مل جيبكو). خلايا الورم الميلانيني البشري MeWo (HTB-65 ، ATCC) ، خلايا MeWo-DSP1 المشتقة من خلايا MeWo التي تعبر عن DSP1-7, MeWo-DSP2 يعبر عن DSP8-11 [28] ، وخلايا MeWo-DSP1 التي تعبر عن shRNA ضد FKBP1A ، وخلايا MeWo-DSP1 التي تعبر عن shRNA ضد CNB1 ، وخلايا MeWo LifeAct-tGFP التي تعبر عن ببتيد قصير مدمج مع tGFP الذي يرتبط بـ F-actin [33] تم نشرها في أقل وسط أساسي. (MEM ، Corning) مكمل بـ 10٪ FBS ، والأحماض الأمينية غير الأساسية (1X ، Corning) ، والبنسلين (100 U / ml ، Gibco) ، الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل ، Gibco) ، والأمفوتريسين B (0.5 ميكروغرام / مل ، Corning ). تم الاحتفاظ بخلايا MeWo-DSP1 و MeWo-DSP2 و MeWo-DSP1 التي تعبر عن shRNA ضد FKBP1A و MeWo-DSP1 التي تعبر عن shRNA ضد CNB1 و MeWo LifeAct-tGFP تحت اختيار بوروميسين (5 ميكروغرام / مل Gibco). تم نشر خلايا HEK293T (CRL-3216 ، ATCC) باستخدام وسط Dulbecco المعدّل لـ Eagle (DMEM ، Corning) مع 10 ٪ FBS ، البنسلين (100 U / ml ، Gibco) ، الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل ، Gibco) والأمفوتريسين B ( 0.5 ميكروغرام / مل ، كورنينج). تم نشر سلالة Oka الأبوية لـ VZV (pOka) المشتقة من كروموسوم بكتيري اصطناعي قابل للاستئصال الذاتي (BAC) [80] وفيروس pOka-TK-RFP المصمم هندسيًا للتعبير عن طلب تقديم العروض الأحادي المترافق مع كيناز ثيميدين (TK) [33] ، ومعايرتها على خلايا MeWo.

مقايسة الانصهار المراسل عالية الإنتاجية

NIHCC (مجموعة عيادات المعاهد الوطنية للصحة 446 مركبًا ، Evotec) ، LOPAC (مكتبة المركبات الفعالة دوائيًا 1280 مركبًا ، سيجما ألدريتش) ، طيف Microsource (2000 مركب ، Discovery System ، Inc.) ، مكتبة الأنشطة الحيوية المعروفة SCREEN-WELL ICCB (480 مركبًا ، Enzo Life Sciences) ومكتبة الأدوية المعتمدة من SCREEN-WELL FDA (640 مركبًا ، Enzo Life Sciences) المتوفرة من مركز العلوم الحيوية عالية الإنتاجية (HTBC) في جامعة ستانفورد ، تم تقييم إجمالي 4846 مركبًا لتأثيرها على VZV gB / gH -gL بوساطة اندماج الخلايا. باختصار ، تم نقل 7.2 × 10 7 خلايا CHO-DSP1 مع 144 ميكروغرام لكل من pCAGGS-gB [27] و pME18S-gH [TL] [27] و pcDNA3.1-gL [22] بلازميدات باستخدام Lipofectamine 2000 (Invitrogen) . تم اختيار ناقل gH [TL] الذي يفتقر إلى آخر ثمانية أحماض أمينية (834-841) في المجال السيتوبلازمي على النوع البري gH لأن gH [TL] يوفر نسبة إشارة إلى ضوضاء محسنة. تم اختيار خلايا CHO-DSP1 على خلايا MeWo-DSP1 كخلايا مستجيبة لأن خلايا CHO تحقق معدل انتقال أعلى ، مما يزيد من النسبة المئوية للخلايا المستجيبة التي تعبر عن البروتينات السكرية الثلاثة معًا ، وبالتالي يزيد من فرصة حدوث اندماج الخلية. بينما كان ترنسفكأيشن جاريًا ، تم تثبيت مكتبات المركبات في آبار مكونة من 384 طبقًا جيدًا (Greiner Bio-One) محملة مسبقًا بـ 30 ميكرولتر / وسط جيد في منشأة HTBC. في 6 ساعات بعد ترنسفكأيشن ، تم حصاد خلايا CHO-DSP1 المنقولة وإعادة تعليقها في وسط 45 مل MEM لتحقيق 1.6 × 10 6 خلية / مل ، وخلطها مع أربعة أحجام (180 مل) من خلايا MeWo-DSP2 عند 1.5 × 10 6 خلية / مل. تمت إضافة ثقافة الخلية المختلطة إلى 384 لوحة جيدة عند 30 ميكرولتر / بئر باستخدام نظام التوزيع الآلي (موزع الكاشف WellMate Microplate مع المكدسات ، المصفوفة). تم تحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة قبل قياس نشاط Renilla luciferase من إعادة تكوين DSP بسبب اندماج الخلية. بالنظر إلى العدد الكبير من 384 لوحة جيدة في هذه التجربة ، فإن الوقت الإجمالي لقراءة اللوحة قد يصل إلى 50 دقيقة ، وهو ما يتجاوز النافذة الزمنية للتألق المستقر (دقيقتان) الناتجة عن ركيزة coelenterazine التقليدية. تم اختيار ركيزة الخلية الحية Enduren (Promega) كركيزة بديلة لأنها يمكن أن تولد إشارة التلألؤ المستمر حتى 24 ساعة. للقراءة ، تم توزيع 20 ميكرولتر / بئر 1X ركيزة خلية حية Enduren في الآبار باستخدام نظام موزع آلي (موزع الكاشف Multidrop 384-well Microplate ، Titertek) ، متبوعًا بساعتين حضانة عند 37 درجة مئوية. تم الكشف بعد ذلك عن تألق رينيلا باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة Infinite M1000 PRO-Multimode 384-well (Tecan). تم اختبار قابلية الخلية للبقاء أيضًا مع صرف 10 ميكرولتر / بئر 1X ركيزة مضيئة من CellTiter-Glo (Promega) ، وتم قياس التلألؤ الناتج على النحو الوارد أعلاه. كانت الضوابط الإيجابية للمقايسة عبارة عن آبار تحتوي على خلايا ولكن بدون أي معالجة مركبة (ن = 512). يعتبر ترنسفكأيشن مع بلازميدات المركبات pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) و pME18S [27] بمثابة عنصر تحكم سلبي للاندماج (n = 256) ، بينما الآبار ذات الوسيط فقط كعنصر تحكم سلبي لحيوية الخلية (n = 256). أجريت التجربة في نسخة مكررة.

تم تحليل بيانات HT-SRFA باستخدام Microsoft Excel. كان متوسط ​​قيم Z لتلألؤ Renilla و CellTiter-Glo من التجارب المكررة 0.53 ± 0.08 و 0.67 ± 0.10 على التوالي ، مما يثبت صحة الفصل الجيد بين عناصر التحكم الإيجابية والسلبية في كلتا القراءات ، وكانت جودة الفحص في مجموعة ممتازة (1 & gt Z '≥ 0.5) لمقايسات الغربلة عالية الإنتاجية [81]. تم تطبيع قيم تألق Renilla و CellTiter-Glo luminescence للآبار المركبة الاختبارية وتقديمها كنسبة مئوية من متوسط ​​آبار التحكم الإيجابية داخل الصفيحة. كان متوسط ​​معامل الاختلاف (CV٪) للضوابط الإيجابية على الاندماج وحيوية الخلية 14.9٪ و 9.9٪ على التوالي. تم التخلص من المركبات ذات قيمة بقاء الخلية خارج ± 3 CV ٪ (≥129.7 ٪ و 70.3 ٪) على أنها توزيع خاطئ للخلايا أو يحتمل أن تكون سامة ، وبالتالي حددت الشاشة في البداية 167 مركبًا أثرت بشكل كبير على انصهار الخلية المعتمدة على gB / gH-gL على زيادة أو نقصان قابل للتكاثر بأكثر من ± 3 CV٪ من الاندماج (≥ 144.7٪ أو 55.3٪) 95 مركبًا محسّنًا و 72 اندماجًا مثبطًا. ومع ذلك ، نظرًا لأن خلايا CHO-DSP1 تشتمل على 20٪ من الخلايا / البئر ، فقد يتم التعرف بشكل خاطئ على مركب سام لخلايا CHO فقط على أنه مثبط للاندماج لأن موت الخلية بنسبة 20٪ كان أقل من الحد الأقصى لصلاحية الخلية. لذلك ، تم تحديد ملفات تعريف سمية خلايا CHO للمركبات الـ 72 المصنفة كمثبطات من قاعدة بيانات HTBC ، مما أدى إلى التخلص من 58 مركبًا. عندما تمت إزالة المركبات التي تم تضمينها أكثر من مرة في المكتبات ، تم العثور على 71 (1.5٪) من المركبات الفريدة لتعزيز الاندماج و 9 (0.2٪) تثبيط الاندماج.

التحقق من صحة المركبات من HT-SRFA

تم حل Tacrolimus (FK506) (Selleckchem) ، و pimecrolimus (Selleckchem) ، و sirolimus (Selleckchem) ، و أيونوميسين (مختبرات Alomone) في DMSO (Sigma Aldrich). تم تقييم نشاط المركبات على انصهار الخلية بوساطة VZV gB / gH-gL عن طريق اختبار الانصهار المراسل المستقر كما هو موضح سابقًا [28]. باختصار ، تم حصاد خلايا CHO-DSP1 أو MeWo-DSP1 بكميات متساوية من pCAGGS-gB و pME18S-gH [TL] و ​​pcDNA3.1-gL البلازميدات باستخدام Lipofectamine 2000 في 6 ساعات بعد تعداء الجسم ، وخلطها مع MeWo- خلايا DSP2 في وجود تركيزات مختلفة من المركبات المحضرة في تخفيفات متسلسلة ذات شقين ، تتراوح من 10 ميكرومتر إلى 1.25 ميكرومتر. تم زرع الزراعة المشتركة للخلايا في لوحات Nunc MicroWell ذات 96 بصريًا (ThermoFisher) وحضنت لمدة 48 ساعة. تمت قراءة نشاط Renilla luciferase فورًا بعد إضافة الركيزة h-Coelenterazine (تقنية Nanolight). يعتبر ترنسفكأيشن مع بلازميدات المركبات فقط pcDNA3.1 (+) و pME18S أو pcDNA3.1 (+) و pME18S و pCAGGS-gB بمثابة تحكم سلبي. تم قياس صلاحية الخلية باستخدام الركيزة CellTiter-Glo Luminescent (Promega). تم تسجيل إشارة التلألؤ باستخدام قارئ Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader (BioTek). تم إجراء التجارب على الأقل في ثلاث نسخ.

فحوصات اندماج المراسل المستقر

تم نقل خلايا المستجيب المعتمدة على الفحص ، CHO-DSP1 ، و MeWo-DSP1 ، و FKBP1A ضربة قاضية MeWo-DSP1 ، أو ضربة قاضية CNB1 MeWo-DSP1 ، باستخدام VZV pCAGGS-gB ، و pME18S-gH [TL] ، وبلازميدات pcDNA3.1-gL ، أو HSV-1 pCAGGS-gB و pME18S-gH و pcDNA3.1-gL و pCAGGS-gD بلازميدات أو pHCMV-ERVW1Δ16 (هدية من جورج مورفي ، جامعة ستانفورد ، ستانفورد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) بلازميد مع Lipofectamine 2000. ERVW1Δ16 بلازميد ، الذي يشفر شكلاً من أشكال syncytin-1 البشري مع اقتطاع ستة عشر حمضًا أمينيًا من المجال السيتوبلازمي ، تم اختياره لأنه يمكن أن يولد نسبة إشارة إلى ضوضاء أفضل في قراءات الاندماج [82]. في 6 ساعات بعد ترنسفكأيشن ، تم حصاد الخلايا المنقولة وخلطها مع خلايا MeWo-DSP2 في وجود DMSO ، pimecrolimus (10 ميكرومتر) ، أو sirolimus (10 ميكرومتر) لمدة 48 ساعة إضافية. تمت قراءة نشاط Renilla luciferase فورًا بعد إضافة الركيزة h-Coelenterazine (تقنية Nanolight) على قارئ Synergy H1 Hybrid متعدد الأوضاع (BioTek).

الكمي لسطح الخلية gB و gH-gL

تم قياس كمية البروتينات السكرية VZV على سطح الخلية كما هو موضح سابقًا [18]. باختصار ، تمت معالجة خلايا CHO-DSP1 المنقولة إما بـ pCAGGS-gB ، أو pME18S-gH [TL] و ​​pcDNA3.1-gL بلازميدات متوسطة ، DMSO ، أو pimecrolimus (10 ميكرومتر) لمدة 24 ساعة. تم إزاحة الخلايا باستخدام مخزن مؤقت لتفكك الخلايا خالية من الإنزيم (Gibco) ، وتم إصلاحه بنسبة 1 ٪ بارافورمالدهيد (PFA ، Boston Bioproducts) ، وأعيد تعليقه في محلول FACS للتلطيخ [PBS مع 0.2 ٪ من ألبومين المصل البقري IgG الخالي من IgG (Jackson ImmunoResearch) ، و 0.1٪ NaN3 (سيجما الدريتش)]. تم الكشف عن سطح الخلية gB أو gH (الذي يمثل gH-gL heterodimer) مع الأجسام المضادة الأولية لكل من الفئران المضادة لـ VZV gB mAb (SG2-2E6 ، GeneTex # GTX38718) ، أو الفأر المضاد لـ VZV gH mAb (SG3 ، GeneTex # GTX40374) ، كل 1: 100 تخفيف ، يليه مضاد للفأر IgG-Alexa Fluor 555 (ThermoFisher). تم إجراء الكميات الإجمالية لإنتاج البروتين السكري الفيروسي بواسطة نفس بروتوكول التلوين ، باستثناء تم نفاذ الخلايا باستخدام مجموعة Cytofix / Cytoperm (BD Biosciences) قبل إضافة الأجسام المضادة الأولية وأثناء إجراء التلوين. تم تحليل الخلايا الملطخة باستخدام محلل DXP متعدد الألوان FACScan (Cytek Biosciences) ، وتمت معالجة البيانات باستخدام FlowJo (TreeStar) لتحديد كمية المستويات الإجمالية والسطحية لـ gB و gH على التوالي. تم أيضًا حساب نسبة سطح الخلية إلى الكمية الإجمالية. أجريت التجارب في ثلاث نسخ.

بناء خط خلية ضربة قاضية FKBP1A و CNB1 shRNA

تم استخدام تعبير shRNA المستند إلى miR30 مع نظام التغليف المتجه pGIPZ lentiviral. تم تصميم اثنين من أزواج استنساخ shRNAs التي تستهدف FKBP1A (المشفرة بواسطة جين FKBP1A) أو نسخ CNB1 (المشفرة بواسطة جين PPP3R1) باستخدام موقع sigma bioinformatics (http://www.sigmabioinfo.com/Informatics_tools/batch-search.php#sh ). أدت الخطوة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بوليميراز الحمض النووي AccuPrime Pfx (Invitrogen) إلى توليد shRNA oligos. تمت إضافة خطوة PCR الثانية إلى التسلسل المتبقي لشريط miR30 وأيضًا مواقع إنزيم تقييد الاستنساخ باستخدام Adapter-miR30PCRXhoI_Forward [28] و Linker-miR30linkerNotI_Reverse ، أو Linker-miR30linkerNotI_Forward و Adapter-miR30PCREcoRI_Reverse [28]. تم حل منتجات PCR النهائية على هلام agarose بنسبة 4٪ ، تمت تنقيته بواسطة مجموعة QIAquick لاستخراج هلام (Qiagen) ، وهضمها باستخدام XhoI / NotI أو NotI / EcoRI (New England Biolabs). تم أيضًا هضم ناقل pGIPZ-DSP1 الذي تم الإبلاغ عنه سابقًا [28] باستخدام XhoI / EcoRI ، وإزالة الفسفرة باستخدام فوسفاتاز أنتاركتيكا (New England Biolabs) ، وفصله على هلام agarose بنسبة 0.8 ٪ ، وتنقيته على النحو الوارد أعلاه. تم ربط المنتجات المنقاة معًا باستخدام T4 DNA ligase (New England Biolabs) ، وتحويلها إلى خلايا E.coli TOP10F 'Electrocomp (Invitrogen). تم بعد ذلك طلاء الخلايا على ألواح LB المكملة بالمضادات الحيوية أمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل ، سيجما ألدريتش) وزيوسين (25 ميكروغرام / مل ، جيبكو). تم تأكيد الاستنساخ الصحيح عن طريق هضم إنزيم التقييد باستخدام MluI / XhoI (New England Biolabs) ، متبوعًا بالتسلسل باستخدام تسلسل pGIPZ-shRNA [28]. تم سرد جميع المواد الأولية المستخدمة أعلاه في جدول S4.

تم إنشاء فيروسات Lentiv عن طريق عدوى 1.2 × 10 6 خلايا HEK293T مع 2.5 ميكروغرام من ناقل pGIPZ-DSP1 أو ناقل pGIPZ-DSP1 الذي يحتوي على FKBP1A أو CNB1 shRNAs المبني أعلاه ، 2.5 ميكروغرام psPAX2 (Addgene # 12260) ، و 1 ميكروغرام pMD2.G (Addgene # 12260) ، و 1 ميكروغرام pMD2.G 12259) باستخدام Lipofectamine 2000. في 24 ساعة بعد تعداء العدوى ، تم حصاد المادة الطافية المحتوية على الفيروس وترشيحها من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر (Fisher Scientific). تم بعد ذلك نقل 1.5 × 10 6 خلايا MeWo باستخدام طاف 1 مل من الفيروس البطيء مع البوليبرين (4 ميكروغرام / مل ، سيجما ألدريتش) عن طريق الطرد المركزي للخلايا عند 750 قوة الطرد المركزي النسبية (RCF) لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتوليد خلايا تحكم MeWo-DPS1 ، ضربة قاضية FKBP1A MeWo-DSP1 أو ضربة قاضية CNB1 لخلايا MeWo-DSP1. تمت إضافة Puromycin (5 ميكروغرام / مل من Gibco) في 24 ساعة بعد النقل للاختيار من أجل مجموعة الخلايا المنقولة بنجاح ، وتم نشر الخلايا في وجود بوروميسين هنا.

تم حصاد الحمض النووي الريبي من الخلايا باستخدام محلول RLT (Qiagen) وعزله باستخدام أعمدة QIAshredder (Qiagen) ومجموعة RNeasy Plus الصغيرة (Qiagen). تم إنشاء (كدنا) من الحمض النووي الريبي المعزول باستخدام نظام التوليف الأول SuperScripIII (Invitrogen). تم إجراء PCR الكمي (qPCR) باستخدام cDNA باستخدام SsoAdvanced Universal SYBR green supermix (BioRad) والبادئات qPCR (جدول S4) ، على نظام الكشف عن PCR في الوقت الحقيقي CFX384 (BioRad) في ثلاث نسخ. تم تطبيع النتائج مع جين التدبير المنزلي ، PGM1 ، وتم تحليل المقارنات على أساس ΔΔCt باستخدام CFX Manager (BioRad).

المنسدلة FKBP1A له الموسومة

تم نقل خلايا CHO-DSP1 باستخدام التحكم في plasmid pcDNA 3.1 (+) أو plasmid pcDNA3.1_huFKBP1A-His-Myc [83]. في 24 ساعة بعد تعداء الخلايا ، تم تفكيك الخلايا في محلول تحلل [50 ملي مولار الصوديوم2ص4 (فيشر العلمي) ، 300 ملي كلوريد الصوديوم (فيشر العلمي) ، 10 ملي مولار إيميدازول (سيجما ألدريتش) ، 0.05٪ توين 20 (سيجما ألدريتش) ، درجة الحموضة 8.0] مع مثبط البروتياز الخالي من EDTA (سيغما ألدريتش) لمدة 30 دقيقة على الجليد. تم طرد العينة عند 3000 RCF لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة حطام الخلية ، وتم حفظ المادة الطافية كمستخلص خلوي. تم ترسيب عشرة أحجام من مستخلص الخلية بحجم واحد من خرز Ni-NTA agarose (Qiagen) التي تمت معايرتها مسبقًا (Qiagen) عند 4 درجات مئوية طوال الليل ، متبوعًا بالغسيل باستخدام محلول الغسيل [50 ملي مولار الصوديوم.2ص4، 300 ملي كلوريد الصوديوم ، 20 ملي إيميدازول ، 0.05٪ توين 20 ، درجة الحموضة 8.0]. في هذه الأثناء ، تم استخراج خلايا MeWo-DSP1 باستخدام المخزن المؤقت للتحلل أعلاه ومعالجته بـ DMSO ، 10 ميكرومتر من tacrolimus ، 10 ميكرومتر pimecrolimus أو 10 ميكرومتر sirolimus لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية مع الدوران النهائي ، متبوعًا بالحضانة مع حبات agarose Ni-NTA التي تم إعدادها أعلاه FKBP1A عند 4 درجات مئوية طوال الليل. تمت إزالة البروتينات المرتبطة من الحبيبات باستخدام محلول شطف [50 ملي مولار الصوديوم2ص4، 300 ملي كلوريد الصوديوم ، 250 ملي إيميدازول ، 0.05٪ توين 20 ، درجة الحموضة 8.0] ، متبوعًا بتحليل النشاف الغربي.

تم فصل الكريات الخلوية التي تم جمعها بالطرد المركزي عند 500 RCF لمدة 5 دقائق في محلول استخلاص [0.1 مولار كلوريد الصوديوم ، 5 ملي مولار بوكل (فيشر العلمي) ، 1 ملي مول كلوريد الكالسيوم2 (فيشر العلمية) ، 0.5 ملي MgCl2 (Fisher Scientific) ، 1٪ IGEPAL CA-630 (Sigma Aldrich) ، 1٪ Deoxycholate (Sigma Aldrich) في محلول 0.1 M Tris ، درجة الحموضة 7.2] ، مع مثبط البروتياز الخالي من EDTA ، لمدة 30 دقيقة على الجليد. تم طرد العينة عند 3000 RCF لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية للتخلص من حطام الخلية ، وتم حفظ المادة الطافية كمستخلص خلوي. تم تخفيف مستخلص الخلية بنسبة 1: 1 في محلول مؤقت لعينة Laemmli 2X (BioRad) مكملًا بكاشف مختزل بنسبة 5 ٪ β-mercaptoethanol (Sigma Aldrich) ، وتم غليه عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، وفصله على مادة مسبقة الصب 4

20٪ هلام SDS-PAGE متدرج (BioRad). تم بعد ذلك نقل البروتينات إلى أغشية Immobilon-P PVDF (Millipore) باستخدام خلية نقل شبه جافة SD Trans-blot (BioRad) في مخزن مؤقت للنقل [48 مللي مولار قاعدة تريس (فيشر العلمية) ، 39 مللي مولار جلايسين (فيشر ساينتيفيك) و 0.01٪ SDS (Sigma Aldrich) ، مع 20٪ ميثانول (Sigma Aldrich)]. تم فحص البروتينات المنقولة باستخدام FKBP1A الأساسي المضاد للإنسان في الأرانب (ThermoFisher # PA1-026A ، 1: 2500) ، الماوس أحادي النسيلة المضاد للكلسينورين B1 (Sigma Aldrich # C0581 ، 1: 3000) ، الماوس أحادي النسيلة مضاد للإنسان α-Tubulin (Sigma Aldrich # T5168 ، 1: 5000) ، أو أرنب متعدد الأضلاع مضاد للإنسان الكالسينورين A (تشوير الخلية رقم 2614S ، 1: 1،000) مخفف في محلول الفحص [20 مللي مولار قاعدة تريس ، 150 مللي مولار كلوريد الصوديوم ، 0.1٪ توين 20 مع 1٪ IgG خالية من BSA ، درجة الحموضة 7.6] ، تليها حضانة الأجسام المضادة IgG المضادة للأرانب أو المضادة للفئران IgG الفجل المرتبط بالبيروكسيديز (GE Healthcare Life Sciences ، UK Ltd. ، 1: 10000) و Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate (ThermoFisher) . تم الكشف عن التلألؤ الكيميائي باستخدام BioMax MR Film (Carestream). تم إجراء تحليل كثافة النطاق باستخدام ImageJ.

الفحص المجهري للخلايا الحية (كنفوكل)

تم زرع خلايا LifeAct-tGFP MeWo في NuncLab-Tek II Chambered Coverglass (ThermoFisher) عند 2 × 10 5 خلية / سم 2 24 ساعة قبل الإصابة بـ pOka-TK-RFP. بدأ العلاج بـ DMSO أو pimecrolimus (10 ميكرومتر) عند 2 نقطة في البوصة. عند 24 نقطة في البوصة ، تم تغيير الوسط ليحتوي على 2 ميكروغرام / مل Hoechst 33342 (ThermoFisher) بالإضافة إلى DMSO أو pimecrolimus (10 ميكرومتر). تم إجراء التصوير الحي على الفور في منشأة ستانفورد لعلوم الخلايا والتصوير (CSIF) باستخدام مجهر (كنفوكل) LSM 880 (زايس). عند التكبير 20X ، تم التقاط بؤر العدوى كل 8 دقائق لمدة 16 ساعة.تم إنشاء أفلام الفاصل الزمني باستخدام FFmpeg (FFmpeg Developers ، (2016) ، أداة ffmpeg (الإصدار be1d324) [برنامج]. متاح من http://ffmpeg.org/).

مقايسة الإزاحة النووية NFATC1 بالمجهر الفلوري

تم نقل خلايا MeWo أو خلايا MeWO-DSP1 أو خلايا MeWo-DSP1 (4 × 10 5) المصنفة على غطاء زجاجي (Fisher Scientific 18CIR-1) باستخدام 1 ميكروغرام من EGFPC1-huNFATc1EE-WT بلازميد (Addgene # 24219 ، تم إيداعه بواسطة جيري كرابتري) [84]. في 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن ، عولجت الخلايا بالمتوسط ​​، DMSO ، أيونوميسين (1 ميكرومتر) ، تاكروليموس (10 ميكرومتر) ، pimecrolumus (10 ميكرومتر) أو سيروليموس (10 ميكرومتر) لمدة 30 دقيقة ، أو تمت معالجتها مسبقًا باستخدام tacrolimus (10 ميكرومتر) ، pimecrolumus (10 ميكرومتر) أو sirolimus (10 ميكرومتر) لمدة 30 دقيقة قبل العلاج الإضافي لمدة 30 دقيقة من أيونوميسين (1 ميكرومتر). لاختبار إزاحة NFATC1 في الخلايا المصابة بـ VZV ، تم نقل خلايا MeWo (2 × 10 6) المصنفة في 6 أطباق جيدة بـ 5 ميكروغرام من بلازميد EGFPC1-huNFATc1EE-WT وتريبسينيزيد في 6 ساعات بعد ترنسفكأيشن للبذور على الغطاء الزجاجي ، ثم تم تلقيحها بفيروس pOka-TK-RFP لمدة 16 ساعة إضافية قبل العلاج من تعاطي المخدرات. ثم تم إصلاح الخلايا بنسبة 4٪ PFA وتم تلطيخها بـ 10 ميكروغرام / مل Hoechst 33342. تم التقاط الصور على مجهر مضان BZ-X710 (Keyence) في عدسة زيت 100X. تم تنفيذ دمج القنوات باستخدام ImageJ.

تم تلقيح الطبقات الأحادية لخلايا MeWo (1 × 10 5 خلية / سم 2) بـ 5 وحدة تشكيل لوحة (PFU) لكل سم 2 من فيروسات pOka المرتبطة بالخلايا لمدة ساعتين ، متبوعة بإضافة وسيط أو DMSO أو pimecrolimus (10 ميكرومتر) ). تم تغيير الوسيط المحتوي على الدواء كل 48 ساعة قبل أن يتم إصلاح الخلايا بنسبة 4 ٪ من PFA في 4 أيام بعد الإصابة. تم إجراء الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) على الخلايا الثابتة باستخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر المضاد لـ VZV (مختلط ، GeneTex # GTX38720 ، 1: 2000 مخفف في PBS) ، متبوعًا بالحضانة باستخدام IgG المضاد للفأر الحيوي (Vector Laboratories # BA-9200) ، والستربتافيدين الفوسفاتيز القلوي (Jackson ImmunoResearch # 016-050-084). تم تصور اللويحات عن طريق تلطيخها بمزيج من ملح FastRed (Sigma Aldrich) و Naphthol AS-MX phosphate (Sigma Aldrich). تم التقاط صور للويحات بواسطة مجهر Axio (Zeiss) باستخدام عدسة 2.5X. تم تحديد اللويحات وتم حساب مساحة اللويحة باستخدام Image J. Monolayers من خلايا MeWo المصابة التي تمت معالجتها بصبغة IHC تم أخذها أيضًا بواسطة مجهر مضان BZ-X710 (Keyence) عند عدسة 2X ، وتم تحليل تردد البلاك والمساحة المصابة الكلية بواسطة عد الجسيمات التلقائي ImageJ. وقد أجريت تجارب على الأقل ثلاث مرات.

تحليل منحنى نمو VZV

تم تلقيح الطبقات الأحادية لخلايا MeWo (1 × 10 5 خلية / سم 2) بـ 100 PFU لكل سم 2 من فيروسات pOka المرتبطة بالخلايا لمدة ساعتين ، تليها إضافة متوسطة ، DMSO ، أو pimecrolimus (10 ميكرومتر). تم تغيير الوسيط المحتوي على الدواء كل 48 ساعة. تم حصاد الخلايا المصابة كل 24 ساعة حتى 4 أيام بعد الإصابة ، وتمت معايرتها على طبقات أحادية جديدة من خلايا MeWo في ثلاث نسخ ، يليها التثبيت بنسبة 4٪ PFA في 4 أيام بعد الإصابة ثم تلطيخ IHC.

مطياف الكتلة لتخصيب الفوسفوببتيد

عولجت خلايا MeWo بالتحكم في المركبات DMSO أو pimecrolimus (10 ميكرومتر) لمدة ساعتين قبل أن يتم استخراج البروتينات الخلوية الكلية بنسبة 2٪ SDS ، ومخزن Tris ، ودرجة الحموضة 7.6 ، في وجود مثبطات الفوسفاتيز [20 ملي مولار (سيغما الدريتش) ، 1 مم نا3صوت4 (سيغما الدريتش) ، و 1 ملي مولار جليسرين (سيجما الدريتش)]. تم تحليل ثلاث عينات مكررة بيولوجية لكل حالة عن طريق إثراء الفوسفوببتيد Zr-IMAC ، متبوعًا بمقياس الطيف الكتلي Orbitrap الذي تم إجراؤه في مرفق قياس الطيف الكتلي بجامعة ستانفورد.

تم إجراء تحديد الببتيد والبروتين باستخدام Byonic V3.5.0 (مقاييس البروتين) بمعدل اكتشاف خاطئ 1٪. تم تحديد البروتينات الفسفورية الفريدة في العينات المعالجة بـ pimecrolimus ولكن ليس في العينات المعالجة بـ DMSO باستخدام كود مكتشف البروتين أحادي الفوسفوبروتين الذي تم إنشاؤه لهذه الورقة باستخدام MatLab (Mathworks). تم إنشاء نماذج الالتحام المتوافقة مع الكالسينيورين من ركائز الكالسينيورين المعروفة بواسطة WebLogo 3 [85 ، 86] ، بينما تم تحديد نماذج الالتحام المحتملة على البروتينات الفسفورية التي تم تحديدها حديثًا بواسطة محاذاة Clustal Omega (EMBL-EBI) باستخدام نماذج الإرساء المتفق عليها.

المعلومات الداعمة S1 الشكل يعتمد تأثير pimecrolimus على اندماج الخلية على معقد gB و gH / gL.

الثقافة المشتركة للخلايا المستهدفة MeWo-DSP2 مع خلايا المستجيب CHO-DSP1 (A) أو MeWo-DSP1 (B) المنقولة بالبلازميدات التي تعبر عن VZV gB / gH [TL] -gL (gB / gH-gL) ، ناقلات فارغة (ناقلات ) أو البلازميد الذي يعبر عن gB فقط (gB) لم يعالج (متوسط) أو عولج بـ DMSO ، أو tacrolimus (10 ميكرومتر) ، pimecrolimus (10 ميكرومتر) ، سيروليموس (10 ميكرومتر) لمدة 48 ساعة. تم قياس كفاءة اندماج الخلايا وتطبيعها مع خلايا المستجيب المنقولة بواسطة gB / gH [TL] -gL وغير المعالجة (٪ gB / gH-gL وسط). يعني ± SEM تمثيل ≥ 3 تجارب مستقلة. تم تقييم الفروق الإحصائية من خلال مقارنة القيم مع تلك الخاصة بالخلايا المستجيبة المنقولة بالـ gB ومعالجتها بـ DMSO باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه (ns ، غير مهم **** ، p & lt 0.0001).

S2 Fig آثار pimecrolimus على التعبير عن gB و gH / gL والاتجار بهما.

(أ) خلايا CHO-DSP1 المنقولة بالبلازميدات التي تعبر عن VZV gB أو gH [TL] / gL ، لم تتم معالجتها (متوسطة) أو عولجت بـ DMSO ، أو pimecrolimus (10 ميكرومتر) لمدة 24 ساعة. تم تحليل التعبير الكلي وسطح الخلية لـ gB أو gH عن طريق قياس التدفق الخلوي للخلايا النفاذة أو nonpermeabilized المناعي. تم تطبيع عدد الخلايا التي تعبر عن gB أو gH كإجمالي أو على سطح الخلية إلى الوسط غير المعالج (٪ الوسط) على التوالي. يتم عرض يعني ± SEM من ثلاث تجارب مستقلة. (ب) تم تطبيع مستوى التعبير عن gB أو gH من (A) على سطح الخلية إلى مستوى التعبير الكلي وتم تقديمها كنسبة مئوية من الإجمالي. تمثل الأقواس الفروق الإحصائية التي تم تقييمها بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه (ns ، not هام *** ، p & lt 0.001 **** ، p & lt 0.0001).

حركية التكرار S3 Fig VZV في وجود pimecrolimus.

لم يتم معالجة خلايا MeWo المصابة بـ pOka (متوسطة) ، وعولجت بـ DMSO أو pimecrolimus (10 ميكرومتر) لمدة 4 أيام ، تم تغيير الوسائط كل 48 ساعة. تم حصاد الطبقات الأحادية من الخلايا المصابة ومعايرتها على خلايا MeWo جديدة لتحديد PFU / ml. يتم عرض النتيجة التمثيلية من تجربتين مستقلتين ، مع تحليل متوسط ​​± SEM بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه (** ، p & lt 0.01).

S1 Movie Record لتكوين VZV syncytia في وجود DMSO عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر للخلايا الحية.

خضعت خلايا LifeAct-tGFP MeWo المصابة بـ pOka-TK-RFP التي عولجت بالتحكم في السيارة DMSO للفحص المجهري متحد البؤر بالخلايا الحية بين 24

40 نقطة في البوصة ، مع الالتقاط يتم كل 8 دقائق. تم الكشف عن الخلايا المصابة بواسطة طلب تقديم العروض (أحمر) ، وخيوط الأكتين بواسطة LifeAct-tGFP (أخضر) ، ونواة ملطخة بـ Hoechst 33342 (أزرق). معدل عرض الإطارات: 5 إطارات / ثانية.

S2 Movie سجل لتكوين مخلوط VZV في وجود pimecrolimus عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر للخلايا الحية.

خضعت خلايا LifeAct-tGFP MeWo المصابة بـ pOka-TK-RFP المعالجة بـ pimecrolimus (10 ميكرومتر) للفحص المجهري متحد البؤر للخلايا الحية بين 24

40 نقطة في البوصة ، مع حدوث الالتقاط كل 8 دقائق. تم الكشف عن الخلايا المصابة بواسطة طلب تقديم العروض (أحمر) ، وخيوط الأكتين بواسطة LifeAct-tGFP (أخضر) ، ونواة ملطخة بـ Hoechst 33342 (أزرق). معدل عرض الإطارات: 5 إطارات / ثانية.

مركبات الجدول S1 من HT-SRFA مع تأثير كبير على الانصهار بوساطة VZV gB / gH-gL.

يشير [C] إلى تركيز المركبات المستخدمة في HT-SRFA ، والانصهار (٪) هو قياس نشاط Renilla luciferase الذي تم تطبيعه مع عناصر التحكم الإيجابية داخل الصفيحة (بدون عقار). يتم عرض المتوسط ​​من تجربة مكررة.

جدول S2 البروتينات المفسفرة الفريدة التي تم اكتشافها في خلايا MeWo المعالجة بـ pimecrolimus بواسطة مطياف الكتلة لإثراء الفوسفوببتيد Zr-IMAC.

تم عرض البروتينات الفوسفورية الموجودة حصريًا في ثلاث عينات مستقلة من خلايا MeWo المعالجة بـ pimecrolimus (Pim1 و Pim 2 و Pim 3). يشار إلى مواقع الانقسام بالنقطة السوداء. يتم تمييز تعديلات الفسفرة بالسيرين (S [+80]) أو الثريونين (T [+80]) باللون الأحمر. يشير M [+16] إلى أكسدة الميثيونين ، ويشير C [+71] إلى تعديل بروبيوناميد السيستين.

S3 Table Calcineurin زخارف لرسو السفن الموجودة على ركائز معروفة من الكالسينيورين.

S4 Table Primers لـ shRNA معربًا عن بناء الخلية وتحليل RT-qPCR.


شاهد الفيديو: افضل 6 مصادر نباتية للبروتين. بروتين لبناء العضلات وانقاص الوزن (قد 2022).


تعليقات:

  1. Odell

    ATP أحبه!

  2. Wes

    بيننا يتحدث ، في رأيي ، واضح. لقد وجدت إجابة سؤالك في google.com

  3. Bardan

    آسف ، لكن هذا الخيار لا يناسبني. ربما هناك المزيد من الخيارات؟

  4. Beadurof

    أنا اشترك في كل ما سبق. دعونا نناقش هذه القضية.



اكتب رسالة