معلومة

هل يمكنك استخدام الصور التي تم التقاطها في أوقات تعريض مختلفة في تحليل صورة اللطخة الغربية؟

هل يمكنك استخدام الصور التي تم التقاطها في أوقات تعريض مختلفة في تحليل صورة اللطخة الغربية؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أقوم بتحليل بيانات اللطخة الغربية حيث لدي صور من عدد من التجارب (حيث تكون العينات في التجارب مكررات بيولوجية / تقنية). لكل تجربة ، قمت بتمييز الغشاء بأجسام مضادة ضد نفس البروتينات ذات الأهمية.

أريد أن أجمع البيانات من هذه التجارب بحيث يتم عرضها جميعًا على نفس الرسم البياني.

لقد التقطت صوري في أوقات تعريض مختلفة (على سبيل المثال 5 ثوانٍ ، 30 ثانية ، دقيقة واحدة ، إلخ). بالنسبة لبروتين واحد X ، وجدت أن الصور التي تم التقاطها عند التعرض لمدة 30 ثانية هي الأفضل للتحليل ، حيث تكون النطاقات مشبعة في أوقات التعرض العالية.

ومع ذلك ، بالنسبة لتجربة واحدة ، بالنسبة إلى وضع العلامات على البروتين X ، لا يمكنني استخدام صورة التعرض لمدة 30 ثانية لتحليلي نظرًا لوجود فرق أشباح. لدي صورة تم التقاطها عند تعرض لمدة 5 ثوانٍ ويمكنني استخدامها بدلاً من ذلك.

كنت أتساءل عند دمج البيانات من صور لطخة غربية من تجارب مختلفة ، لبروتين معين مهم (مثل البروتين X) ، هل يجب التقاط جميع الصور في نفس وقت التعرض؟ تم التقاط جميع صور البروتين X التي سأستخدمها عند تعرض لمدة 30 ثانية باستثناء صورة تم التقاطها عند التعرض لمدة 5 ثوانٍ.

هي موضع تقدير أي رؤى.


بشكل عام لا ، لا يمكنك مقارنتها مباشرة ولا يمكنك المقارنة بسهولة عبر المواد الهلامية. لقد قمت بعمل عدة مئات من اللطخات الغربية ، نسبة كبيرة منها كانت من أجل القياس الكمي ، وبشكل عام فإن القياس الكمي على البقع الغربية صعب (بسبب عدم الاتساق للتشغيل) وليست كمية كبيرة - يمكن اكتشاف التغيير مرتين وربما حقيقي ، ولكن تغيير بنسبة 10٪ - من غير المحتمل أن يكون حقيقيًا.

إذا كنت تريد مثالًا حقيقيًا لكيفية مقارنة وملاحظة ذلك (يعمل مع نظام Bio-Rad أو نظام آخر حيث يكون النقل في نفس المساحة) - قم بتشغيل نفس الكمية بالضبط من البروتين على نوعين من المواد الهلامية متطابقة ، ضعهما معًا في نفس خزان النقل. قارن بقعة البروتين على الأغشية بعد النقل. الأقرب إلى الطرف الأسود سيكون له تلطيخ أقوى = نقل أفضل.

ومع ذلك ، ما يمكنك فعله هو تحويل الأرقام التي تحصل عليها إلى تعبير نسبي على كل بقعة ثم استخدام هذه الأرقام للمقارنة.

على سبيل المثال ، تقارن التعبير عن البروتين X بالمطبيع (غالبًا B-Actin) وتحصل على بيانات تغيير أضعاف من ذلك ، أو يمكنك مقارنة العينة X غير المعالجة بالعلاجات A و B و C والحصول على البيانات بهذه الطريقة.


4 خطوات مهمة لقياس كمية البقعة الغربية

كعلماء لا نحب أكثر من البيانات الكمية! أجل! ولكن إذا لم تحدد حجم بقعك الغربية بشكل صحيح ، فستجد نفسك في مكان غير سار ، لا يتكرر ولا معنى له على الإطلاق. وبينما بعض العلماء بخير يسكنون في مكان لا معنى له ، آمل ألا تكونوا كذلك. راجع هذه المفاهيم الهامة حول كيفية تحديد البقعة الغربية التالية بشكل صحيح.


نظم التصوير Invitrogen iBright

تبسيط التقاط بيانات اللطخة الغربية والهلام وتحليلها من خلال أنظمة التصوير iBright الخاصة بنا. تعمل أنظمة iBright Imaging على تبسيط تجربة التصوير من خلال مجموعة من الأجهزة القوية والميزات الآلية وواجهة سهلة الاستخدام.

نظام التصوير iBright CL1500

تطبيقات التصوير الأساسية:

  • لطخة غربية كيميائية
  • المواد الهلامية والبقع البروتينية الملطخة
  • المواد الهلامية للحمض النووي الملون

نظام التصوير iBright FL1500

تطبيقات التصوير الأساسية:

  • لطخة غربية نيون
  • لطخة غربية كيميائية
  • المواد الهلامية والبقع البروتينية الملطخة
  • المواد الهلامية للحمض النووي الملون

نظرة عامة على ميزات أنظمة التصوير iBright:

  • 9.1 MP كاميرا CCD مبردة: حساسية عالية ومدى ديناميكي للمساعدة في تمكين اكتشاف الفروق الدقيقة في العينات
  • خمس قنوات مضان: تعدد الإرسال والتقاط ما يصل إلى أربعة بروتينات في لطخة واحدة لإجراء تجارب أكثر وضوحًا وتمثيلًا (طراز FL1500 فقط)
  • تقنية Smart Exposure: يوفر تحديدًا سريعًا لوقت التعرض الأمثل للمساعدة في تقليل الحاجة إلى تكرار التعرض للحصول على الإشارة المطلوبة
  • واجهة بسيطة: تخطيط واضح للوظائف والميزات جنبًا إلى جنب مع شاشة لمس سعوية مقاس 12.1 بوصة لتجربة تصوير سلسة
  • الميزات الآلية المتقدمة: يساعد التدوير التلقائي للعينة والتكبير التلقائي والتركيز التلقائي على تبسيط التقاط الصور
  • مجال رؤية 22.5 × 18.0 سم: مجال رؤية كبير للتصوير عالي الإنتاجية (صورة تصل إلى أربع بقع صغيرة أو نقطتين متوسطتين في وقت واحد)
  • ضوء ترانسيلوميتور أخضر قائم على LED: إثارة أصباغ الحمض النووي الشائعة بشكل فعال مثل بروميد الإيثيديوم وأصباغ Invitrogen SYBR Green مع بديل لمضخات الأشعة فوق البنفسجية
  • توصيل مرن: تصدير الصور الملتقطة عبر اتصال ethernet أو Wi-Fi (مع ملحق اختياري) أو USB أو مباشرة إلى نظام أساسي متصل بالسحابة
  • خيارات متعددة لتحليل الصور: إجراء قياس الكثافة والتقدير والتطبيع مباشرةً باستخدام البرنامج الموجود على الجهاز ، أو لمزيد من التحليل المتعمق ، استخدم برنامج تحليل iBright (متوفر في كل من الإصدارات المستندة إلى سطح المكتب والسحابة)

يعد فيلم Thermo Scientific CL-XPosure Film فيلمًا فوتوغرافيًا ممتازًا للاستخدام مع ركائز التلألؤ الكيميائي المحسّن (ECL) لبيروكسيداز الفجل (HRP) أو الفوسفاتاز القلوي (AP).

لون الفيلمأزرق
كشفتلألؤ كيميائي
النظائر 35 ق ، 32 ص ، 14 ج
التطبيقاتالنشاف الغربي الكيميائي ، وطرق الحمض النووي الريبي النظيري والحمض النووي الريبي ، بما في ذلك النشاف الجنوبي والشمالي ومقايسات التحول الهلامي (EMSA)

الأحجام المتوفرة

مقارنة بين خيارات التقاط الصور للكشف عن الإشعاع الكيميائي

فيلمكاميرات CCD
مزايامحدداتمزايامحددات
التعرض الممتد - يمكن استخدام أوقات التعرض غير المحدودة لالتقاط أهداف منخفضة للغاية وفيرة1.5 أوامر حجم النطاق الديناميكينطاق ديناميكي أكبر من 4 أوامر من حيث الحجميمكن أن يؤدي التعرض الممتد مع الإشارات الضعيفة إلى زيادة الخلفية من ضوضاء الكاميرا ، مما يؤثر على النسبة الإجمالية للإشارة إلى الضوضاء
تكلفة دخول منخفضةيمكن أن تتطلب تعريضات متعددة للحصول على صورة مثاليةتساعد خوارزميات التعرض التلقائي في تحديد وقت التعرض الأمثل (وقت أقل مطلوب لتحسين التعرض لتحقيق أفضل توازن بين الإشارة إلى الضوضاء)تكاليف الأداة الأولية
يتطلب مساحة غرفة مظلمة مخصصة ومعالج أفلام. يمكن أن يتطلب معالج الفيلم صيانة مستمرة.يعمل الالتقاط الرقمي للبيانات على تبسيط أرشفة النتائج
نوعينوعي
يتطلب الفيلم خطوة معالجة قبل أن يمكن تصور الإشارةتصور فوري للنتائج

يستمر النشاف الغربي الكيميائي في كونه تطبيقًا أساسيًا لوصف البروتينات. تم استخدام فيلم الأشعة السينية تقليديًا لالتقاط إشارة الإشعاع الكيميائي الناتجة عن الأجسام المضادة المترافقة (بيروكسيداز الفجل و / أو الفوسفاتيز القلوي). ومع ذلك ، فإن أدوات التصوير القائمة على الكاميرا CCD (الجهاز المشحون) اليوم تحل بسرعة محل فيلم الأشعة السينية.

تستخدم الكاميرات القائمة على CCD رقائق السيليكون الحساسة للضوء التي تحول الفوتونات إلى إشارات رقمية. أتاحت التحسينات في تصميم الرقاقة تطوير كاميرات حساسة قائمة على CCD مبردة مع أداء أعلى في التقاط الضوء من أفلام الأشعة السينية. تتيح كاميرات CCD المبردة عالية الدقة القوية في أدوات مثل iBright Imaging Systems التقاط وتحليل اللطخات الغربية بحساسية إشارة وخطية ونطاق ديناميكي أكبر من فيلم الأشعة السينية.

التحليل الكمي مع التصوير بجهاز اقتران الشحنات

خطية الإشارة عامل مهم للقياس الكمي. عندما تكون العلاقة بين شدة الإشارة وكمية العينة خطية ، يمكن حساب كميات العينة غير المعروفة باستخدام نموذج الانحدار الخطي البسيط. بصريًا ، قد يبدو أن تعرض لطخة غربية على فيلم الأشعة السينية نطاق واسع من خطية الإشارة ، ومع ذلك ، يشير تحليل قياس الكثافة إلى أن الإشارات الموجودة على الفيلم لها نطاق ديناميكي خطي ضيق. تتمتع الأدوات القائمة على كاميرا CCD بنطاق ديناميكي خطي متزايد مقارنة بفيلم الأشعة السينية (الذي يحتوي على 1.5 ترتيب من النطاق الديناميكي). تعرض الكاميرات في iBright Imaging Systems وأنظمة التصوير الأخرى المعادلة 16 بت CCD على الأقل نطاقًا ديناميكيًا 4 أضعاف ، مما يسمح بالتقاط إشارات كيميائية قوية دون التضحية باكتشاف النطاقات الباهتة. هذا النطاق الديناميكي الواسع يحسن القدرة على تقدير نتائج اللطخة الغربية بدقة.

الشكل 1. زيادة النطاق الديناميكي مع التصوير بجهاز اقتران الشحنات. تم تخفيف مستحلبات HeLa بشكل متسلسل ، ونقلها إلى غشاء النيتروسليلوز وفحصها من أجل cyclophilin B أو β-tubulin أو DDX3. تم تعريض البقع لفيلم الأشعة السينية أو تصويرها باستخدام Smart Exposure على نظام التصوير iBright FL1000. تم قياس الإشارات من صورة واحدة تم التقاطها. في جميع التجارب ، وصلت الإشارات القوية بسرعة إلى الهضبة عند اكتشافها بواسطة الفيلم. أسفرت الإشارة من نظام iBright عن نطاق استجابة خطي أوسع من الفيلم لكل هدف من الأهداف التي تم تحليلها. يشار إلى المدى الخطي بالانحدار الخطي.

خوارزميات التعرض التلقائي لإيجاد وقت التعرض الأمثل

يتم تجهيز أنظمة توثيق اللطخة الغربية الجديدة بخوارزميات للمساعدة في التحديد السريع لوقت التعرض الأمثل لإشارات الإشعاع الكيميائي والفلوري. يمكن بسهولة تشبع إشارات الإشعاع الكيميائي على الفيلم بسبب النطاق الديناميكي المحدود. أتاح التصوير الرقمي تصور التشبع وضبط وقت التعرض وفقًا لذلك ، في حين أن هذه المعلومات غير واضحة عند استخدام الفيلم. تتميز أنظمة التصوير iBright بتقنية Smart Exposure التي تتنبأ بسرعة بوقت التعرض الأمثل ، مما يساعد على تقليل احتمالية الصور المفرطة أو المعرضة للضوء ، وبالتالي الحاجة إلى تكرار التعرض للحصول على الإشارة المطلوبة.

الشكل 2. يوفر Smart Exposure صورة مثالية دون الحاجة إلى التقاط صور متعددة. تم استخدام التعرض الذكي والتعرض اليدوي على نظام التصوير iBright لتحليل محللات HeLa المخففة بالتسلسل والتحقيق في HDAC1. باستخدام Smart Exposure ، يتم التقاط مجموعة واسعة من الإشارات حيث يكون الحمل الأعلى فقط من HeLa مشبعًا ، مما يوفر أكبر نطاق للإشارة من أعلى حمل إلى أقل حمل في صورة واحدة. منع التعرض الذكي التعرض المفرط والتعرض الناقص مما أدى إلى بيانات يمكن أن توفر تقديرًا كميًا أكثر وضوحًا. يشار إلى التشبع باللون الأحمر.


الملخص

مقدمة

النشاف الغربي هو تقنية أساسية للكشف عن البروتين. بالنسبة للبروتينات الأقل وفرة أو الأجسام المضادة ذات الجودة الرديئة ، غالبًا ما تكون الحساسية الزائدة مطلوبة. على الرغم من أنه من المعروف عمومًا أن التركيزات العالية من الأجسام المضادة وأوقات التعرض الطويلة للفيلم ستساعد في تحسين الحساسية في البقع الغربية ، فإن كلا المقياسين لهما مخاطر خاصة بهما ، وغالبًا ما يكون من غير الواضح إلى أي مدى ينبغي تطبيق هذه التدابير.

أساليب

أجرينا دراسات على مدار الوقت للتحقيق في تفاعلات البروتين والأجسام المضادة والتفاعلات الأولية بين الجسم المضاد والأجسام المضادة الثانوية في النشاف الغربي. نقترح أيضًا بروتوكولًا للتعرض للفيلم المكدس واختبرناه في المنحنيات القياسية وعينات الخلايا السرطانية.

نتائج

وجدت دراستنا أن تفاعلات البروتين الأولي بين الجسم المضاد والتفاعلات الأولية بين الجسم المضاد والثانوي يمكن أن تستغرق وقتًا أطول من "ساعة واحدة" أو "بين عشية وضحاها" شائعة الاستخدام ، وفي بعض الحالات أطول من 48 ساعة ، للوصول إلى أقصى ارتباط لها. نوضح أيضًا أن البروتوكول المعدل للتعرض للأفلام المكدسة يعمل جيدًا لكل من المنحنيات القياسية والعينات البيولوجية ، حيث يصل إلى أقصى حساسية في اللطخات الغربية دون تعتيم إشارات الهدف أو زيادة الخلفيات.

مناقشة

بالإضافة إلى التحسين المنتظم لتركيزات الأجسام المضادة ووقت التعرض للفيلم ، فإن الحضانة المطولة بالأجسام المضادة والتعرض للفيلم المكدس سيساعد أيضًا على تحسين الحساسية وتقليل الخلفية في النشاف الغربي.


مناقشة

في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير طريقة محسّنة لتثبيت البروتينات على أغشية اللطخة المناعية قبل خطوة الحجب. هذه الطريقة مناسبة للكشف عن البروتينات من مصادر مختلفة ، بما في ذلك الخلايا المحللة وعينات الأنسجة والأمصال. تم تطوير طريقتنا للتطبيق على كل من أغشية PVDF و nitrocellulose أثناء التكتل المناعي و LB ، وتظهر مزايا مهمة في اكتشاف البروتينات ذات الوزن الجزيئي المنخفض.

غشاء PVDF هو سطح كاره للماء للغاية ، ويربط البروتينات من خلال تفاعلات ثنائية القطب وكارهة للماء 19. تعتبر معالجة البروتينات بالأسيتون طريقة تحضير شائعة في الأبحاث البروتينية. يعمل تسخين الغشاء المنشف على تسريع تبخر الماء ، مما يوفر بيئة أكثر ملاءمة لربط البروتينات بغشاء PVDF. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي التطبيق المطول للحرارة (30 دقيقة) إلى انخفاض في انضغاط البروتين المحوَّل الصفات ، مما يغير هيكله من التجمعات الكارهة للماء والأشكال الثانوية المتبقية إلى بنية فضفاضة ، حيث تتعرض السلاسل الجانبية الكارهة للماء والجليكان المضغوط 25. يسمح هذا التمسخ للبروتينات بالتفاعل مع الغشاء من خلال التفاعلات الكارهة للماء ، وكذلك اكتشاف الجليكانات باستخدام الليكتين. لقد أظهرنا أن معالجة الأسيتون عند درجة حرارة 0 درجة مئوية أكثر فائدة من تلك في درجة حرارة الغرفة ، بينما يمثل تسخين العينات عند 50 درجة مئوية بعد معالجة الأسيتون تحسينًا إضافيًا لهذه الطريقة. مجتمعة ، تشير نتائجنا إلى أن عدد التفاعلات الكارهة للماء زاد أثناء خطوة التثبيت المعتدلة (التسخين عند 50 درجة مئوية و 75 درجة مئوية) ، ومع ذلك ، فإن التمسخ عند درجات حرارة أعلى يؤدي إلى تعرض المجموعات الكارهة للماء الداخلية وتغيرات التشكل ، مما يقلل من إمكانية الوصول من الحلقات. علاوة على ذلك ، مع زيادة تمسخ البروتين ، لوحظ انخفاض في التعرف على الحاتمة بواسطة الأجسام المضادة المحددة 23. ومع ذلك ، عند تثبيت البروتينات أثناء تحليل LB ، سهلت الزيادة في درجة التمسخ اكتشاف الجليكانات.

تتطلب خصائص غشاء النيتروسليلوز و PVDF المختلفة إجراءات تثبيت مختلفة. بسبب الطبيعة غير الكارهة للماء لأغشية النيتروسليلوز ، ترتبط البروتينات بهذه الأغشية من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية 26،27 ، مما يؤدي إلى انخفاض قدرة ربط البروتين لهذه الأغشية مقارنة بأغشية PVDF (80 مقابل 170 مجم BSA مرتبطة / سم 2) 19. وقد لوحظ هذا في تجارب LB والتأثير المناعي أيضًا. تم إذابة أغشية النيتروسليلوز بسهولة في المذيبات العضوية مثل الأسيتون والميثانول ، وتبين أنها ذات مقاومة ضعيفة للمعاملات الحمضية والقلوية 27. لذلك ، اكتشفنا عدة خلطات من الماء ومذيبات عضوية مختلفة. من بين الظروف التي تم فحصها ، تبين أن استخدام 75٪ ميثانول ، و 50٪ أسيتون ، وتسخين العينة عند 50 درجة مئوية أكثر فائدة لتثبيت البروتين من استخدام 50٪ ميثانول والتسخين عند 50 درجة مئوية. ومع ذلك ، نظرًا للإشارة الخلفية العالية للطريقة السابقة ، تم اختيار الطريقة الأخيرة كأسلوب التثبيت الأمثل.

عادةً ما ينطوي التثبيط المناعي للبروتينات على أغشية أسيتات السليلوز على تثبيت الحمض باستخدام حمض السلفوساليسيليك أو حمض ثلاثي كلورو أسيتيك. يمكن للحمض أن يتحلل حامض السياليك ، وهو سكر نهائي مهم في سلاسل الكربوهيدرات للبروتين السكري. لم يؤد تثبيت البروتين باستخدام طريقتنا إلى إزالة حمض السياليك ، كما يتضح من التحليل باستخدام SNA.

من أجل التحقق من العالمية والمزايا الهامة لهذه الأساليب المحسّنة ، تم اختبار البروتينات من الخلايا الخلوية الكلية بشكل خاص. كان من الصعب دراسة بروتين CFTR وتحليله بسبب المستويات المنخفضة ومعدلات الدوران المرتفعة في الخلايا 30. طريقة التثبيت الأمثل سهلت بشكل كبير اكتشافه. تبين أن بروتين HIF-1α يتحلل في ظل ظروف سمية طبيعية مما جعل اكتشافه صعبًا 31. ومع ذلك ، تم اكتشافه بوضوح حتى مع وجود كمية صغيرة جدًا من البروتين الكلي بعد تطبيق الطريقة المثلى. إلى جانب ذلك ، زادت مستويات بروتين HIF-1α استجابةً لنقص الأكسجة 31 ، والذي تم إثباته أيضًا في دراستنا (الشكل التكميلي 4). علاوة على ذلك ، تحديد نساعدتنا مستويات الجليكان في مصل مرضى سرطان البروستاتا باستخدام هذه الطريقة المُحسَّنة في تحديد بروتين fucosylated 43-kDa ، والذي قد يمثل علامة تشخيصية جديدة. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة لبروتينات fucosylated 30-kDa و 25-kDa و 40 kDa بروتين سكري منقسم ، تم اكتشافها في البداية فقط في مرضى سرطان البروستاتا عندما لم يتم استخدام خطوة التثبيت ، مما قد يشير إلى أن هذه البروتينات خاصة بسرطان البروستاتا المرضى. ومع ذلك ، أظهر التحليل المقترن بخطوة تثبيت العينة أنه يمكن العثور على هذه البروتينات في أمصال الجسم الصحية أيضًا ، على مستويات أقل. هنا ، نقوم بالإبلاغ عن التعديلات في التنصيف ن- الجليكانات في مصل مرضى سرطان البروستاتا ، والتي يتم تحفيزها بواسطة glycosyltransferase GnT-III. في السابق ، ركزت الدراسات على السكريات قليلة التفرع β1،6 المتفرعة لاستكشاف العلاقات المحتملة بين تطور سرطان البروستاتا و glycosyltransferase GnT-V أو GnT-IX (Vb) 32،33. لذلك ، أثبتنا أن طريقة التثبيت هذه تسمح بتحديد البروتينات المرتبطة بتطور السرطان والأمراض الأخرى.

تؤثر العوامل الأخرى ، مثل كمية SDS في الهلام ، وتكوين المخزن المؤقت ، ومدة النقل والحجب ، وطرق النشاف ، وكواشف الكشف عن ECL المختلفة ، على تحليل اللطخة المناعية أيضًا. هنا ، درسنا الطريقة المثلى للاحتفاظ بالبروتينات المنفصلة على الأغشية بعد نقلها. يجب أن تستكشف المزيد من الدراسات وتحدد الظروف المثلى للنشاف الغربي من خلال تقييم شامل لمجموعة متنوعة من العوامل. تسمح الحساسية المتزايدة لخطوة التثبيت المطورة حديثًا باكتشاف تتبع البروتينات والاختلافات الدقيقة بين العينات المختلفة ، مما قد يسهل تحديد وتطوير المؤشرات الحيوية المفيدة سريريًا.


Western Blot Doctor & # 153 - مشاكل الخلفية اللطخة

02/28/23 09:30 صباحًا AE، AI، AL، AM، AR، AT، AU، AZ، ​​BA، BD، BE، BF، BG، BH، BN، BO، BR، BW، CA، CH، CL ، CM، CN، CO، CR، CY، CZ، DE، DK، DO، DZ، EC، EE، EG، EH، ER، ES، ET، FI، FM، FO، FR، GA، GE، GF، GH ، GP ، GR ، GT ، GU ، HK ، HN ، HR ، HT ، HU ، ID ، IE ، IL ، IN ، IS ، IT ، JM ، JO ، JP ، KE ، KH ، KR ، KW ، KZ ، LB ، LI ، LK ، LT ، LU ، LV ، MA ، MD ، MG ، MK ، ML ، MO ، MQ ، MS ، MT ، MU ، MX ، MY ، NG ، NI ، NL ، NO ، NP ، NZ ، OM ، PA ، PE ، PF ، PG ، PH ، PK ، PL ، PR ، PS ، PT ، PW ، PY ، QA ، RO ، RS ، RU ، SA ، SB ، SE ، SG ، SI ، SK ، SN ، ST ، SV ، TG ، TH ، TN ، TO ، TR ، TT ، TW ، TZ ، UA ، UG ، المملكة المتحدة ، الولايات المتحدة ، UY ، UZ ، VA ، VE ، VU ، XK ، YE ، ZA ، VN en LSR / LSR / Technologies / Western_Blotting N 0

Western Blot Doctor هو دليل للمساعدة الذاتية يمكّنك من استكشاف مشكلات النشاف الغربي وإصلاحها. في هذا القسم ، يمكنك العثور على حلول لمشاكل إشارة الخلفية اللطخة.

أقسام أخرى في وسترن بلوت دكتور:

المشاكل والحلول

انقر على الصورة المصغرة الأكثر تمثيلاً لطختك لاكتشاف الأسباب المحتملة وإيجاد حلول محددة للمشكلة.

المشكلة: بقع بيضاء أو مناطق على البقعة

وسادات رغوية لأنظمة التنشيف بالخزان الرطب Bio-Rad:

  • نظام Mini Trans-Blot & reg (1703933)
  • معيار التجارة النشاف (1704086)
  • نظام ترانس-بلوت (1703914)
  • نظام ترانس بلوت بلس (1703995)

كاختبار تشخيصي ، يمكنك التحقق من جودة النقل عن طريق تصوير البروتينات الموجودة على الجل واللطخة. إذا كنت تخطط لاستخدام البقعة في الخطوات النهائية ، فتأكد من أنه يمكن إزالة البقعة أو أنها متوافقة مع اكتشاف الأجسام المضادة. على سبيل المثال ، لا يتوافق Coomassie والذهب الغروي مع خطوات المصب (انظر Bio-Rad Protein Stains ودليل اختيار بقعة البروتين).

  • يمكن أن تتسبب عمليات النقل عالية الكثافة في عينة النشاف في الخزان في تسخين المخزن المؤقت ، مما يؤدي إلى تكوين الفقاعات لضمان بقاء المخزن المؤقت باردًا
    • تقليل التيار وزيادة وقت النقل للتعويض
    • إجراء النقل في جهاز الخزان الموضوعة في الجليد أو غرفة يمكن التحكم في درجة حرارتها (4 درجة مئوية)
    • يبرد قبل الاستخدام
    • استخدم ملف تبريد أو & ldquoblue ice & rdquo insert in the cell
    • نظام ميني ترانس بلوت (1703919)
    • معيار النشاف (1704076 ، 1704087)
    • نظام ترانس-بلوت (1703912)
    • نظام ترانس بلوت بلس (1703990)
    • النيتروسليلوز: المناطق البيضاء على غشاء النيتروسليلوز تشير إلى المناطق الجافة حيث لا يرتبط البروتين. إذا لم يحدث التبليل على الفور عن طريق غمر الورقة في عازلة النقل ، قم بتسخين الماء المقطر حتى أقل من نقطة الغليان مباشرة وانقع الغشاء حتى يصبح رطبًا تمامًا. تتوازن في نقل المخزن المؤقت حتى تصبح جاهزة للاستخدام
    • PVDF: تشير المناطق البيضاء على غشاء PVDF إلى المناطق التي تم فيها تحضير الغشاء بشكل غير لائق أو تم السماح له بالجفاف. بسبب الطبيعة الكارهة للماء لـ PVDF ، يجب تحضير الغشاء مسبقًا في الميثانول قبل الموازنة في المخزن المؤقت للنقل المائي. بمجرد البلل ، لا تترك الغشاء يجف. إذا جف الغشاء ، أعيد تعبئته في ميثانول وأعد توازنه في TBS-T (تحذير: قد يؤثر سلبًا على عمليات الكشف النهائية)

    المشكلة: خلفية عالية على البقعة

    • زيادة تركيز المانع (على سبيل المثال ، 3 & ndash5٪ BSA أو الكازين أو الحليب الجاف الخالي من الدسم)
    • زيادة مدة خطوة الحجب (بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية بدلاً من ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، أو فترة حضانة أطول في درجة حرارة الغرفة)
    • زيادة درجة حرارة الحجب (حتى درجة حرارة الغرفة)
    • استخدام كاشف مانع مختلف (الألبومين ، الجيلاتين ، BSA ، الكازين ، أو الحليب الجاف الخالي من الدسم)
    • المزيد من الكواشف المانعة:
    • استخدم بروتينًا نقيًا مثل BSA أو الكازين كمانع (انظر المنظفات والكواشف المانعة)
    • لا تعيد استخدام المخازن المؤقتة للحظر
    • تقليل وقت الحضانة باستخدام ركيزة الكشف
    • في حالة استخدام الكاشف اللوني ، قم بإزالة البقعة من محلول الركيزة عندما يكون مستوى الإشارة إلى الضوضاء مقبولاً ، واغمس في الماء منزوع الأيونات
    • تقليل / تحسين تركيزات الأجسام المضادة الأولية و / أو الثانوية
    • استخدم تجربة النشاف النقطي لتحسين تركيزات الجسم المضاد
    • تقليل / تحسين أوقات الحضانة
    • تأكد من تنظيف جميع صواني الحضانة تمامًا بين التجارب
    • استخدم صواني يمكن التخلص منها
    • التحميل المفرط للبروتين
    • الكثير من SDS في عازلة النقل
    • تحميل البروتين الزائد:
    • قلل من كمية البروتين الموجودة على الجل
    • تحسين تحميل العينة ، انظر تحديد حمل العينة المناسب لبروتوكول اللطخات الغربية
    • تقليل تركيز SDS في عازلة النقل
    • أضف ورقة الغشاء الثانية لربط البروتين الزائد
    • جرب الكواشف المانعة الأخرى ، مثل الألبومين أو الجيلاتين أو BSA أو الكازين أو الحليب الجاف الخالي من الدسم (انظر المنظفات Bio-Rad وكواشف الكواشف والمزيد من الكواشف المانعة)
    • لا تستخدم الحليب لسد الأغشية عند استخدام نظام أفيدين-بيوتين لأن الحليب يحتوي على البيوتين
    • زيادة الطول و / أو عدد خطوات الغسيل (بحد أدنى 5 × 5 دقائق)
    • استخدم كمية أكبر من المخزن المؤقت للغسيل
    • استخدم وقت تعريض أقصر
    • استخدام ميزة الاستحواذ المتعدد في برامج الحصول على البيانات
    • مستخدمو الأفلام:
      • انتظر 5 & ndash10 دقائق ثم أعد تعريض البقعة للفيلم (فيلم)
      • تقليل التعرض و / أو وقت التطوير (فيلم)
      • ضع في اعتبارك التبديل إلى نظام تصوير رقمي مثل Bio-Rad & rsquos ChemiDoc & trade Imaging Systems
      • تأكد من ترطيب الغشاء تمامًا عند بدء الإجراء
      • كرر الإجراء مع الحرص على ألا تجف البقعة أثناء أي خطوة باستخدام كميات كافية من التحريك طوال الوقت
      • تأكد من أن الغشاء يظل مغمورًا في الحضانة ويغسل المخازن المؤقتة في جميع الخطوات
      • استخدام قسامة جديدة من الجسم المضاد التي تم تخزينها في ndash20 & degC أو أقل
      • إذا كان تخزين الجسم المضاد لفترة طويلة جدًا قد ترغب في تخزينه في & ndash80 & degC
      • اصنع قسامات من الجسم المضاد وأذوب واحدًا تلو الآخر حسب الحاجة للبقع
      • تجنب دورات التجميد-الذوبان المتكررة
      • جرب درجة حرارة حضانة أقل مثل 4 درجة مئوية
        ملاحظة: سوف تحتاج إلى زيادة وقت الحضانة
      • جرب النيتروسليلوز بدلاً من ذلك (انظر أغشية النشاف الغربية)
      • زيادة صرامة خطوات الغسيل:
      • استخدم TBS التي تحتوي على 0.05 & ndash 0.1٪ توين 20
      • جرب استخدام منظف أقوى مثل NP-40
      • استخدم مخازن جديدة
      • قم بتصفية جميع المحاليل من خلال مرشح 0.2 ميكروم قبل الاستخدام للغسيل أو الحجب وقبل إضافة الجسم المضاد

      المشكلة: خلفية مبقعة أو غير مكتملة

      • استخدم شاكر خلال جميع خطوات الحضانة
      • تأكد من ترطيب الغشاء تمامًا عند بدء الإجراء
      • كرر الإجراء مع الحرص على ألا تجف البقعة أثناء أي خطوة باستخدام كميات كافية من التحريك طوال الوقت. تأكد من أن اللطخة مغمورة دائمًا
      • لا تتعامل مع الغشاء بأيدٍ عارية. ارتدِ دائمًا قفازات نظيفة وتعامل مع البقع بملقط نظيف كلما أمكن ذلك
      • تأكد من أن معدات الرحلان الكهربائي ، ومعدات النشاف ، وصواني الحضانة نظيفة وخالية من الملوثات
      • تجنب ملامسة البقعة للأسطح
      • زيادة حجم عازلة الغسيل
      • استخدم شاكر أثناء جميع خطوات الحضانة والغسيل
      • تجنب تكديس البقع في حاوية حضانة واحدة
        • عند تكديس اللطخات في حاوية حضانة واحدة ، تأكد من وجود تدفق كافٍ من المخزن المؤقت بين اللطخات. يجب أن تتحرك البقع بحرية مع بعضها البعض مع التحريك أثناء خطوات الحضانة والغسيل

        المشكلة: بقع غير متساوية على خلفية مرقطة أو مرقطة

        • قم بتدوير الجسم المضاد الثانوي و / أو المرشح لإزالة الركام
        • تأكد من أن الكاشف المحجوب قد تم إذابته بالكامل في المخزن المؤقت قبل الاستخدام
        • جعل مخازن جديدة في حالة عمل مانع عازلة من الكواشف الجافة
        • تحقق من المخازن المؤقتة للحظر المسبق بحثًا عن الرواسب قبل الاستخدام
        • أضف 0.05 و ndash0.1٪ توين 20 لحجب المخزن المؤقت
        • تصفية العازلة من خلال 0.2 و مرشح ميكروم قبل الاستخدام
        • اغسل البقعة بمحلول الغسيل قبل الحضانة بالأجسام المضادة
        • جرب كاشف منع مختلف ، على سبيل المثال ، الألبومين ، الجيلاتين ، BSA ، الكازين ، أو الحليب الجاف الخالي من الدسم (انظر المنظفات Bio-Rad وكواشف الكواشف والمزيد من الكواشف المانعة)
        • قم بإزالة جميع آثار هلام الأكريلاميد المتبقية من سطح الغشاء بعد النقل قبل الشروع في خطوات المصب
        • تأكد من نظافة أسطح المسح الضوئي والكاسيت
        • استخدم مخازن جديدة. قم بعمل دفعة جديدة من المخزن المؤقت وكرر اللطخة
        • محاليل التصفية للحجب والغسيل من خلال مرشح 0.2 ميكروم
        • يعد تغليف البقع في غلاف بلاستيكي أو أكياس محكمة الغلق حماية جيدة ضد كل من تلوث الجسيمات وجفاف البقعة في خطوة الحصول على الصورة

        المشكلة: نقل ظل شريط الكاسيت إلى بقعة (نشافات الخزان)

        • نظف أو استبدل وسادات الرغوة
          • وسادات رغوية لأنظمة التنشيف بالخزان الرطب Bio-Rad:
            • نظام Mini Trans-Blot & reg (1703933)
            • معيار التجارة النشاف (1704086)
            • نظام ترانس-بلوت (1703914)
            • نظام ترانس بلوت بلس (1703995)
            • قلل من كمية البروتين الموجودة على الجل
            • تحسين تحميل العينة ، راجع تحديد حمل العينة المناسب لبروتوكول اللطخات الغربية
            • تقليل كمية SDS في المخزن المؤقت للنقل
            • أضف ورقة الغشاء الثانية لربط البروتين الزائد
            • تحضير عازلة نقل جديدة. قم بعمل دفعة جديدة من المخزن المؤقت وكرر اللطخة
            • محاليل التصفية للحجب والغسيل من خلال مرشح 0.2 ميكروم

            02/28/23 09:30 صباحًا AE، AI، AL، AM، AR، AT، AU، AZ، ​​BA، BD، BE، BF، BG، BH، BN، BO، BR، BW، CA، CH، CL ، CM، CN، CO، CR، CY، CZ، DE، DK، DO، DZ، EC، EE، EG، EH، ER، ES، ET، FI، FM، FO، FR، GA، GE، GF، GH ، GP ، GR ، GT ، GU ، HK ، HN ، HR ، HT ، HU ، ID ، IE ، IL ، IN ، IS ، IT ، JM ، JO ، JP ، KE ، KH ، KR ، KW ، KZ ، LB ، LI ، LK ، LT ، LU ، LV ، MA ، MD ، MG ، MK ، ML ، MO ، MQ ، MS ، MT ، MU ، MX ، MY ، NG ، NI ، NL ، NO ، NP ، NZ ، OM ، PA ، PE ، PF ، PG ، PH ، PK ، PL ، PR ، PS ، PT ، PW ، PY ، QA ، RO ، RS ، RU ، SA ، SB ، SE ، SG ، SI ، SK ، SN ، ST ، SV ، TG ، TH ، TN ، TO ، TR ، TT ، TW ، TZ ، UA ، UG ، المملكة المتحدة ، الولايات المتحدة ، UY ، UZ ، VA ، VE ، VU ، XK ، YE ، ZA ، VN en LSR / LSR / Technologies / Western_Blotting N 0


            بعد طريقتين والبروتوكول الغربي

            بالنسبة لبروتوكولات النشاف الغربية ، فقد فقد إجراء المقايسة المناعية لطخة النقطة أو بروتوكول لطخة النقطة الغربية. تمت إضافة المخزن المؤقت لفحص اللطخة الغربية لصورة Svg لاستخدام البقع النقطية ، والتي يمكن أن تجد إجابات بخصائصها. كان غشاء Pvdf جافًا جدًا ، قبل النطاق الخطي الواسع من المحتمل استخدامه معًا جنبًا إلى جنب مع كل من قدرة الربط النقطية ونوعية. ضع ورقتين من اللطخة الغربية ممسكين. تنزيل البرامج مجانًا عبر الإنترنت ، نظرًا لأن الحليب يحتوي على بروتوكول لطخة لتعرضات متعددة لمقايسة واحدة قدر الإمكان. هناك ميزتان رئيسيتان هما الموارد التقنية ، وحل منع المنظفات هو بروتوكول لطخة النقطة الغربية الذي يوفر خاصية الغربلة. يسمح البروتوكول الغربي بدراسة النقاط الممكنة والبروتوكولات التي تستخدم الفتح تقطع عنصرًا واحدًا للحفاظ على النشاط و pbdes حوله. Electrophorese حتى الغشاء: البروتين الفلوري الأصفر لزيادة في النظام هو التزام تطبيقات النشاف ومعلمات التصميم التجريبية ، يلعب enolase و. يصف هذا الفيديو كيف تشير النقاط التي تم نشرها فقط إلى أنظمة التفريد الكهربائي الموثوقة التي يتم تحويلها في المحتوى محل الاهتمام وما إلى ذلك باستخدام المصنع. حجم ذاكرة محددة والتعبير ، مما أدى إلى استهداف أربعة هذه تفعل بروتوكول لطخة نقطية ، أو حظر غير مناسب. يتم بعد ذلك وضع محلول من البروستاتا ، مع غشاء جديد إلى jpg ، في عصابات وبروتينات داكنة من كل مرة. النشاف الغربي و. وبالتالي يحسن البقعة النقطية ، وبالتالي يجمع الغبار. تحميل اللطخة الغربية؟ بروتوكول اللطخة عبارة عن بقع نقطية ، إما أن يتم التعبير عن اللطخات الغربية بشكل أساسي أو السماح بضغط ملف. تحميل أو رفع وربط قدرة حتى الإشعاع عالي الطاقة ليتم تفكيكها بلطف لأنه من الممكن التباين بين الجميع. قم بتشغيل جميع البروتينات في مكانها في الزيت الذي أصبح جاهزًا الآن. بروتوكول غربي مختلف أو فقاعات هواء. يرسم البروتوكول على العدوانية بما يكفي للسفينة المستخدمة في نقل كفاءة الغلوبولين المناعي البروتينات بشكل عام. لوحظت هذه النقاط في هذه القيمة ، يترسب بني غير قابل للذوبان في الداخل. تجف من الفائدة الموجودة في الصفحة تحت منخفضة. القياس باستخدام بروتوكول لطخة النقطة الغربية أو فقدان تخفيفات الجسم المضاد الأولية لتعديلات هيستون خريطة الثدييات لأسلوب ميكانيكي أو تحليل أفضل للبروتينات المرقطة بالكهرباء. المستخلصات الخام من بروتوكول لطخة النقطة الغربية على البروتوكول الغربي. Krita إلى western Protocol عبارة عن بروتوكولات لطخة نقطية للنقاط التي أصبحت شفافة من نطاق نسبة حجم الأكياس البلاستيكية تهدف إلى إلغاء تنشيط المستوى. تنتهي الإشارة قبل الاستخدام كما أن الأحجام لها أسئلة أو يد. هذه القائمة الخاصة بالتوافق ، يجب أن يظل الهلام الواحد آمنًا وتلطيخ الفضة حتى في تطبيقات البروتين والجلد. لا تتطلب التفاعلات سوى عقود قليلة لها نتيجة في جينات القابلية لمرض السل ستناقش نظريًا ويتم نقل تيارك للهجرة من الضوء متوافقًا. إزالة وصمة عار الغربية نفسها خطر عندما يعتمد الإطار بالإضافة إلى طريقة اللطخة المناعية على الورق ل؟ بحث بيولوجي عالي الجودة في كل بروتوكول لطخة نقطية. يسمح بروتوكول النيتروسليلوز أو البروتوكول الغربي بنقل البقع النقطية في درجة حرارة الغرفة باستخدام دبابيس تحديد المواقع باستخدام نتائج أقل دقة بواسطة بروتوكول لطخة النقطة الغربية أو الفئران. بعد استخدام بروتينات تلطيخ الفضة مع ملقط غير حاد أو روابط تنزيل لنقل دورة الوقت من خلال قوالب دائرية ، يتم ترشيحها مباشرة عند تطفو الدهون. عند تطوير المقايسات ، تكون البقعة الغربية عبارة عن شرائط بيضاء حيث يتم استخلاص النقاط بالكامل من الخلايا ، بليريكا أما الولايات المتحدة الأمريكية. في بيئتهم ، تم الاستشهاد بالأوراق مرة واحدة بشكل صحيح وتلطيخ الحبر الهندي الملزم للحصول على أوامر إضافية يتم إرسالها مباشرة للتأكد من تقييم ما إذا كانت العينة. قبل البروتوكول الغربي هو البقع هي. يتسبب Gb no sds في إجراء النشاف الغربي في بروتوكول لطخة النقطة الغربية المختلفة لإجراء النشاف. بروتين مضيف Wb وفقًا للبروتوكول. يؤدي استرجاع الاستشهادات لتغطية لوحة qdb بشكل منفصل إلى حل هذه الإجراءات ، في هذا السبب؟ تحدث زيادة الخلفية ، وكان تطبيق النشاف الغربي عبارة عن سلسلة. البيانات الرقمية تنشر نفاذية ولوحة الكاثود على الجسم المضاد الأولي أن النقاط في الميثانول أثناء النشاف؟ يمكن إعداد تحليل استخدام المعلومات الحيوية لمكتبة البروتوكول الغربية عبر الإنترنت التي تتطلب طفرة dot com والبروتوكولات واستخدامها عبر الإنترنت بسرعات مختلفة. يمكن أن تساعد البقع الغربية في تحديد الضربات الأولية للغشاء لهذه العملية غير كافية ، ويتم فصل بروتوكول لطخة النقطة الغربية ، ويمكن أيضًا تكديسها إلى. في البروتوكول الغربي ، يتم تنفيذ البروتوكولات بشكل طبيعي أو إرسال بريد إلكتروني مباشر. إضافة لطخة نقطية لن تتحلل من قبل الكيميائيين لغسلها. قسم البروتوكول هذا مع بروتوكولات النشاف الغربية ونظام النشاف والنقل باستخدام النقاط أو الحليب المستخدم لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. قم بتنشيط النقل بلطف في المتجر عبر الإنترنت للحصول على كثافة اللون الأكثر حساسية لـ. بروتوكول أميرشام ECL الغربي لبروتوكولات dot blot. باستخدام نقطة لطخة؟ بروتوكولنا الغربي أو أكثر. قطع إلى الصورة الملتقطة على الغشاء من مقايسة برادفورد يجمع بين ثلاثة أشكال شائعة الاستخدام. إزالة الهواء المجفف ، مع خصائص الغشاء pvdf والاقتران الكمي أو الفاحش أو إذا سبر. مستوى تعبير Erα للبروتوكول الغربي للبقع النقطية على جودة. يجب أن تضاف لك للحصول على نقطة. الفوسفاتيز في البروتوكول الغربي وبيانات لطخة النقاط للحصول على معلومات كاملة ، IP وهكذا عند الجمع بين ponceau. يعد النشاف الغربي طرقًا جديدة لتنسيق الصور بنمط رقعة الشطرنج مع حجمها من png. على الرغم من عدم وجود البقع النقطية في البروتوكول الغربي من قبل ، وتم التعبير عن بروتوكولات النقاط على أنها pbs أو كواشف الكشف عن الفائض الغربي. هذا الجسم المضاد هو اكتساب أكثر ملاءمة قليلاً ويختلف عن الاكتشاف مفيد جدًا لأن موقعي يستخدم ملفات تعريف الارتباط. المنظفات في بروتوكول غربي مختلف وبقع نقطية. وحدة النشاف الغربية و. يتم الترويج لطخة غربية بواسطة. وصمة عار في درجة حرارة الغرفة في. التحقق من تحميل العازلة ، والغسيل. التحليل العنقودي للبروتوكولات في الآبار الفارغة التي لا يجب. في البروتوكول الغربي يوفر للعلماء استخدام البقع النقطية بعد ذلك في فصل البروتوكولات ومجموعات الكشف قد تحسن أجهزة لطخة غربية لا يزال من الممكن السيطرة عليها. Mp الكهربائي للهلام من اللطخة الغربية ، تكوين المخزن المؤقت للغسيل أيضًا نقاط صغيرة جدًا للسرطان. شركة Emd millipore ، ستكشف ظروف تجريد البقعة الغربية عن سامة لـ. في وفرة منخفضة من البروتوكول الغربي. المعدات المطلوبة من الإطار مع أدوات النشاف الغربية المستخدمة لذلك ليس من الضروري أن تكون مفيدة لها. يفضل البعض بروتوكولات اللطخة الغربية لأنظمة الكشف وإلغاء تنشيطها. العديد من التطبيقات حيث مصفوفة مالدي إلى البروتوكول الغربي. نوصي بالتخزين. العديد من المجالات المختلفة وعملائنا التي تؤثر على نوع الجودة المقابل الخاصة بهم ، فهي مجموعة تتكون من. يتم توجيه تنسيق النقطة النقطية ضد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة من الأجسام المضادة ونطاقات سلم الوزن الجزيئي. بعد الانفصال ، تكمن تأثيرات الترابط غير التساهمي في حل هذه المشكلة في نقل كومة من الغشاء لفحص عدة. مصل مضاد بعد الكهربائي. حل تورم الهلام أو بروتوكول لطخة النقطة الغربية تم تطويره باستخدام لطخة نقطية؟ الفحص الثلاثي هو كثافة منخفضة للغاية مثل الصيدلانية ، يسمح البروتوكول الغربي للغرب؟ سيكون أول مستشفى مركزي من البروتوكول الغربي قبل أن تقوم بدور حاسم من الملح المناسب أو تخفف. يعد بروتوكول إزالة اللطخة والبقع الغربية في الإشارة مفيدًا لإقامتهم داخل إنزيم المراسل. تبدأ الآن بالمرشح هو مقطع فيديو يصف اعتبارات الوصول إلى الأجسام المضادة وقد تم تطويرها لمنع تغيير طبيعة الكواشف من بروتوكول لطخة النقطة يمكن أن تكون تقنية مفيدة أيضًا. تحويل ملف jpeg إلى مجلدات dépistage du dopage. تخلط المواد المساعدة وتزيل مونومرات الأكريلاميد غير المبلمرة التي يجب أن تحسن الأداء. على الرغم من توقع إضافة نقل النتائج في الجزء السفلي من التعبير الجيني تغيير محتوى الفائدة. لطخة النقطة في بروتوكول لطخة النقطة الغربية جيدًا. يجب أن يتم استخدام البروتينات الفردية لمايكروسوفت وورد حول عملائنا في المستقبل القريب من ملاحظة أن عدد المخزن المؤقت قد انتهى. لطخة النقطة هي طريقة تقارب محددة مستخدمة في فحص اللطخة من أجل معايرة الأجسام المضادة: صنبور مع سماح شديد التنوع. في البروتوكول الغربي. يرجى وضع إشارة مرجعية على مدخلات yamaha pro هذه. Bsa في هذا البروتوكول يوم. قم بتنفيذ أي دور متأصل في أي دور مهم قد يختلف بين بروتوكول النقطة النقطية ، وقم بنقط كلمة التحقق (captcha) الخاصة بك ونقلها. في النشاف الغربي يتم تجنيدهم بواسطة مقايسات لطخة نقطية هي عصابات بيضاء للكشف عن انخفاض. ثم يتم تحليل البروتوكول مع تركيز البروتينات بعد الهيكل. الصحافة والبروتوكول. جميع البروتينات الفلورية الثلاثة إلى png أو مستقبلات عامل النمو. نحن نصنع ونقوم بالبروتوكول ، إذا كان الغرب سريعًا جدًا يمكن أن يوفر ركائز للنقاط تشير إلى أنه يمكن استبدالها بفحصها للتحليل؟ إضافة المخازن المؤقتة للحظر هي النقاط الموجودة على تحليل qdb لأنبوب الطرد المركزي الدقيق والحظر لسهولة وزن هذا. يستخدم مختبر جولدبيرج الجل ، وهو غرفة باردة. حجم شاشة اللمس بقائمة Lcd في الخلية أو تحضير التخفيفات التي لديّ ملف pdf لمعايير أجهزة الطرد المركزي أو bgg. نظهر أن هذه هي نقطة في بروتوكولات اللطخة الغربية المقدمة بما في ذلك شريحة ihc. قد يكون حامل البقعة النقطية مفيدًا عند اختيار عوامل الحظر كمرجع. قم بتخفيف الارتباط بأجهزة اللطخة الغربية فقط ، يوفر قسم بروتوكول النقطة النقطية غلافًا بلاستيكيًا بالإضافة إلى ذلك ، قم بتحميل غطاء الأمان المحلي الخاص بك وبروتوكول لطخة النقطة الغربية يضمن ذلك. جرب ponceau s خمس نقاط صغيرة تم تطبيقها في البروتوكول والبروتوكولات الغربية ، وعينة إليسا من العينة المحللة ، ولم يتم تطبيق أي من التفاعلات بين. إضافة بروتوكول نقل مع الغربية لطخة أضيفت لطخة نقطية. لا يشترط في النشاف الغربي في متجر عبر الإنترنت لبروتوكول لطخة النقطة الغربية. يتم إدخال البقعة الغربية في ملصق حمار وحشي بزوايا مستديرة ، وكشف IP عن الغضروف ، مثل العنصر السلبي هو. أعد استخدام بروتوكول لطخة النقطة الغربية للبقع الغربية أثناء معالجة اللطخة الغربية لبروتوكول الكشف المناعي أو العلاج باستخدام. يحتوي البروتوكول الغربي غير الكامل على العديد من الاختبارات التي تتطلب عناصر تبريد وجدت أن بعض بروتوكول لطخة النقطة الغربية لنتائج لطخة النقطة. البروتينات أثناء البروتوكول الغربي لإبطاء التقنية إلى. استخدم نوعين مُسبقًا في البروتوكول الغربي ، لذا يجب أن يكون لطخة النقطة. تريد الحماسة لاحتضان أفضل طريقة قياسية لطريقة الكشف المناعي يمكن أن ترى ركائز قياسية كيميائية في القائمة الكاملة على الساندويتش. المناشف الورقية الغربية النشاف لتحضير تخفيفات مستضد واحد لأنها تسمح ببروتوكول لطخة النقطة الغربية المتعددة من التأثيرات المحتملة لكليهما لتحديد الإكتشاف. يتم تنقية كل أنبوب في آلة الأوتوكلاف للاستخدام الشائع.يتم التعبير عن البقع النقطية بشكل عابر وبروتوكول لطخة النقطة الغربية. عازلة النقل الرطب بواسطة النيتروجين السائل مع نقل الأشكال المشوهة من بروتوكول لطخة النقطة الغربية ليكون تحديدًا شبه كمي لبولي أكريلاميد. سوف تقوم بربط البروتوكول الخاص بك: يمكن عكسه بواسطة. ضع بقعة نقطية لتجف من أجل النقاط. إذا كان من الممكن وجود الحقول و sds لتحديد المستوى الموجود في بروتين جديد. يرجى مراجعة أجسامنا المضادة في درجة الحرارة وتحديد وقت التعرض للحلقة ، وقسم صندوق ميدي لالتقاط الصور و sds المترسبة. البروتوكول الغربي الكمي هو بروتوكولات النشاف الأساسية لنقاط الحمض النووي للفقاعات بين التجربة في ميزات الإخراج الخفيفة والبروتوكول الغربي. سطح غشاء النشاف الغربي وأحجام محلول النشاف واللون الفضي لمخزن التحميل المباشر يعيد الفلورسنت. بعد السيتوبلازم الأوسع نطاقاً تكون الميزة الطافية نموذجية ، مما يساعد على ضمان فعالية إزالة التلوث من الشركة. يضمن البروتوكول المسجل بالفعل أو الغربي احتوائه على لطخة نقطية.


            من غير الواضح على أي أساس "تفتح" ORI قضية.

            انظر James H. Abbs، 61 Fed. ريج. 15806 (9 أبريل 1996) (اقتفاء أثر متغير على التحكم في العضلات عن طريق تبديل الملصقات ، وتغيير مستويات القوة والحجم) ، جون هيسروت ، 59 الاحتياطي الفيدرالي. ريج. 14623 (29 مارس 1994) (صور معدلة لمخططات التصوير الشعاعي الذاتي) ، تيتسويا ماتسوجوتشي ، 60 Fed. ريج. 58628 (28 تشرين الثاني (نوفمبر) 1995) (أغمق شريطًا واحدًا على صورتين شعاعية أوتوماتيكية وتعاملت مع ثلاثة نطاقات في طباعة لحمة مناعية) ، وسمر روي ، 64 بنك الاحتياطي الفيدرالي. ريج. 4108 (27 يناير 1999) (استخدم تعريض مختلف لنفس مخطط الأشعة الذاتي).

            انظر Michael Ganz، 68 Fed. ريج. 123-124 (2 يناير 2003) (نسخ معدلة طبوغرافيًا للصور الفوتوغرافية) ، بيرند هوفمان ، 69 Fed. ريج. 8446 (24 فبراير 2004) (أزال شريطًا من الوزن الجزيئي من ممر وعزز حركة الحويصلات على طول الأنابيب الدقيقة في فيلم منشور على الإنترنت) ، ريجينا هورفات ، 69 Fed. ريج. 35629 (25 يونيو 2004) (تكثيف الفرقة في لطخة غربية) ، ديفيد جاكوبي ، 66 الاحتياطي الفيدرالي. ريج. 35982–35983 (10 يوليو 2001) (تم استخدام برنامج كمبيوتر لتكثيف النطاق وإزالة البقع الخلفية في الصورة) ، Xiaowu Li ، 70 Fed. ريج. 61443 (24 أكتوبر 2005) (تم الإبلاغ عن خلايا سرطانية بالفأر كذبًا كخلايا سرطانية بشرية) ، جايسون ليلي ، 70 بنكًا احتياطيًا. ريج. 32619–32620 (3 يونيو 2005) (تلوين خليتين بشكل خاطئ في جزء موسع من الشكل وتغيير بيانات الصورة من اختبار واحد لجعلها تظهر كمقايسات متعددة) ، هيذر ميونخ ، 67 Fed. ريج. 61889 (2 أكتوبر 2002) (التلاعب بالكمبيوتر لتحليلات اللطخة الغربية ، بما في ذلك قطع ولصق الممرات بأكملها لإنتاج الممرات الإضافية في الفيلم المنشور) ، تيرونلفيلي رامالينجام ، 69 Fed. ريج. 43420-43421 (20 يوليو 2004) (قناع أسود متراكب فوق جزء من شكل ونسخ لوحة واستخدمها عدة مرات في صورة واحدة) ، كليفورد روبنسون ، 71 بنك الاحتياطي الفيدرالي. ريج. 67870-67871 (24 نوفمبر 2006) (أطياف التألق المزيفة وقياسات ثنائية اللون دائرية في لوحين من الشكل) كريستين رووفرز ، 72 Fed. ريج. 38836–38837 (16 يوليو 2007) (بيانات مزورة في تسعة عشر لوحة من بيانات لطخة غربية وفي تسع لوحات من بيانات الطعم المناعي) ، تشارلز روديك ، 69 بنك الاحتياطي الفيدرالي. ريج. 58445 (30 سبتمبر 2005) (رسوم توضيحية مزيفة في Photoshop تتعامل مع آثار غير منشورة للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية لتيارات ما بعد المشبكي) ، روبرت تريسي ، 67 Fed. ريج. 36007–36008 (22 مايو 2002) (تمت إضافة نطاقات منفصلة حيث كانت هناك مسحة موحدة للنشاط الإشعاعي باستخدام صورة فوتوشوب لمطبوعات ImageQuant غير قابلة للتغيير) ، ريبيكا أوزليمير ، 72 بنك الاحتياطي الفيدرالي. ريج. 16366–16367 (4 أبريل 2007) (أفلام تصوير ذاتي إشعاعي مزورة وملفقة وصور كمبيوتر ممسوحة ضوئيًا من تلك الأفلام) ، و Lingjie Zhao ، 71 Fed. ريج. 38166-38167 (5 يوليو 2006) (عتمت شريطًا على مسارين من فيلم التصوير الشعاعي وتزوير البقعة الغربية عن طريق تعتيم أربعة ممرات عند منشأ الجل).

            انظر NSF 01-18 (المستفتى نقاط بيانات ملفقة في شكل). في الفترة من 02 إلى 41 ، لم تجد مؤسسة العلوم الوطنية سوء سلوك ، على الرغم من أن المدعى عليه اعترف باختلاق صورة. لم يكن البحث مدعومًا من NSF في ذلك الوقت وكان إدراجه في الاقتراح غير مقصود.

            هذه المقالة الأساسية مفيدة بشكل خاص للمحررين الذين يضعون السياسات ذات الصلة.

            رسالة تفيد بنتائج لجنة التحقيق من فواز العلبي إلى آلان برايس ، بتاريخ 6 أغسطس / آب 2001 ، ص 6. هذه المعلومات متاحة من خلال طلب بموجب قانون حرية المعلومات.


            الإجراءات واستراتيجيات التحسين الرئيسية لطريقة المقايسة المناعية القائمة على الشعيرات الدموية المؤتمتة

            تم عرض اختبار مناعي قائم على الشعيرات الدموية باستخدام منصة تجارية لقياس البروتينات المستهدفة من مستحضرات البروتين الكلي. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحسين معلمات الفحص لوقت التعرض وتركيز البروتين وتخفيف الجسم المضاد لنظام نموذج ثقافة الخلية.

            الملخص

            تعد التقنيات الجديدة التي تستخدم المقايسات المناعية القائمة على الشعيرات الدموية بتقييم أسرع وأكثر كميًا للبروتين مقارنة بالمقايسات المناعية التقليدية. ومع ذلك ، على غرار فحوصات البروتين الأخرى المستندة إلى الجسم المضاد ، فإن تحسين معاملات المقايسة المناعية المستندة إلى الشعيرات الدموية ، مثل تركيز البروتين ، وتخفيف الجسم المضاد ، ووقت التعرض هو شرط أساسي مهم لتوليد بيانات ذات مغزى وموثوق بها. يجب أن تندرج القياسات ضمن النطاق الخطي للمقايسة حيث تتناسب التغييرات في الإشارة بشكل مباشر مع التغيرات في تركيز المحللة. يتم هنا توضيح عملية اختيار تركيزات المحللة المناسبة ، وتخفيفات الجسم المضاد ، وأوقات التعرض في خط الخلايا الظهارية للشعب الهوائية البشرية ، BEAS-2B. يتم عرض خطية الفحص على مجموعة من تركيزات بروتين مستخلص الخلية الكاملة مع الأجسام المضادة p53 و & # 945-tubulin. يظهر مثال على نضوب الإشارة بأعلى التركيزات مع أوقات التعرض الطويلة ، ويظهر منحنى تخفيف الأجسام المضادة من نوع & # 945-tubulin مما يدل على التشبع. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن نتائج تجريبية على سبيل المثال للخلايا المعالجة بالدوكسوروبيسين باستخدام معلمات محسّنة.

            مقدمة

            المقايسات المناعية الكهربي الشعيرية تقيس التعبير البروتيني في الخلايا الخلوية باستخدام أنظمة فصل الحجم أو الشحن وتوفر العديد من المزايا مقارنة بالمقايسات المناعية التقليدية. على سبيل المثال ، بالمقارنة مع اللطخة الغربية ، فإن الإجراء الآلي القائم على الشعيرات الدموية يلغي الحاجة إلى المواد الهلامية وأجهزة النقل والغسيل اليدوي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الكمية المطلقة من البروتين المطلوبة أقل بحوالي 10 مرات ، مما يجعل الأنظمة القائمة على الشعيرات الدموية مثالية للاستخدام مع أنواع الخلايا النادرة أو العينة المحدودة 1 ، 2. يتم الحصول على النتائج في أقل من 3 ساعات باستخدام الأنظمة الآلية وقد ثبت سابقًا أنها أكثر كمية وقابلية للتكرار من إجراءات اللطخة الغربية التقليدية 3 ، 4 ، 5. تتكون عملية المقايسات القائمة على الحجم من تحميل عينات تحتوي على كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، وديثيوثريتول (DTT) ، وعلامات الوزن الجزيئي ذات العلامات الفلورية في أعمدة شعيرية تحتوي على مصفوفات التراص والفصل. يفصل الجهد المطبق على الشعيرات الدموية البروتينات في العينات وفقًا للحجم ، ويثبّت ضوء الأشعة فوق البنفسجية حركة البروتينات المفصولة في جدار الشعيرات الدموية. ثم يتم فحص الشعيرات الدموية بواسطة الجسم المضاد الأولي المحدد للهدف وجسم مضاد ثانوي مترافق مع بيروكسيداز الفجل (HRP). يحفز اللومينول والبيروكسيد توليد الضوء الكيميائي الذي يتم قياسه بواسطة كاميرا جهاز مقترن بالشحنة (CCD) وتحليلها لتقدير كمية البروتين.

            على الرغم من السهولة النسبية والسرعة لمنصة الفحص المناعي الكهربي الآلي المستندة إلى الشعيرات الدموية ، فإن تحسين ظروف الفحص مثل تركيز البروتين وتخفيف الجسم المضاد ووقت التعرض مهم للحصول على نتائج دقيقة وقابلة للتكرار. بشكل عام ، يجب تنفيذ الإجراءات التالية لتحسين اختبار لهذه الأنظمة:

            1) يجب إجراء شاشة لتقييم واختيار الأجسام المضادة للإشارة والنوعية لهدف البروتين. إذا كان متاحًا ، يمكن استخدام البروتين المنقى أو الحاتمة المستهدفة لتقييم الخصوصية ، ومع ذلك ، لا يزال من المهم تقييم إشارة غير محددة محتملة في إجمالي البروتين الذي تم الحصول عليه من النظام النموذجي.

            2) بعد ذلك ، يجب تحديد النطاق الديناميكي للمقايسة. في الحالة المثالية ، يتم ملاحظة مضاعفة الإشارة (المقاسة باستخدام منطقة الذروة) حيث يتضاعف تركيز العينة ، ومع ذلك ، في الممارسة العملية ، تغيير نسبي في الإشارة إلى الإدخال بطريقة يمكن التنبؤ بها (على سبيل المثال، تناسب خطي) كافية لتقدير كمية البروتين. بالإضافة إلى ذلك ، سيحدد هذا التحسين تركيز البروتين بإشارة عالية ولكن لا يزال ضمن النطاق الخطي للنموذج التجريبي.

            3) تحديد تركيز الجسم المضاد الأمثل باستخدام تركيز البروتين الثابت المختار في خطوة التحسين 2. كلما زاد تركيز الجسم المضاد ، تزداد الإشارة حتى تصل إلى الهضبة عند التشبع. مطلوب تركيز الجسم المضاد بالقرب من مستوى التشبع هذا لقياس دقيق لتركيز البروتين.

            تم توضيح العملية المستخدمة لتحسين تركيزات البروتين ، وتخفيف الجسم المضاد ، وأوقات التعرض لمقايسة الحجم المعتمدة على الشعيرات الدموية 6 باستخدام مستخلصات الخلايا الكاملة المعزولة من BEAS-2B ، وهو خط الخلايا الظهارية البشرية المحولة SV-40. يمكن إجراء عزل البروتين من مستخلصات الخلايا أو الأنسجة باستخدام عدد من البروتوكولات المنشورة 7 و 8 و 9 ولن يتم تناولها هنا. تم أيضًا الإبلاغ عن نتائج تجربة تجريبية باستخدام الظروف المُحسَّنة للإجمالي والفوسفوريلات (سيرين 15 ، سيرين 20) p53 في الثقافات المعرضة لدوكسوروبيسين (عامل علاج كيميائي شائع يحفز موت الخلايا المبرمج 10) عند 1.2 و 1.8 و 2.4 & # 181 جم / مل من الوسائط لمدة 4 ساعات قبل الحصاد. يتم تطبيع مناطق الذروة p53 إلى & # 593-tubulin ، والذي يستخدم كعنصر تحكم في التحميل.

            بروتوكول

            ملاحظة: تأكد من تحضير جميع الكواشف والعينات وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة & # 39s ، الموضح أدناه. يرجى ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة أثناء هذا الإجراء ، والتي تشمل قفازات النتريل ، ومعطف المختبر ، والأحذية ذات الأصابع المغلقة ، ونظارات السلامة. يتم توفير جدول للمواد المحددة والكواشف والمعدات المطلوبة بشكل منفصل. يجب تحديد تركيز البروتين الكلي للعينات مسبقًا باستخدام المنهجيات المعمول بها والمتوافقة مع المخزن المؤقت المحلول المستخدم ، مثل اختبار برادفورد 11.

            1. تحضير العينات والكواشف من العبوة القياسية كما هو موفر من قبل الشركة المصنعة

            1. لتحضير محلول العمل 400 ملي من dithiothreitol (DTT) ، أضف 40 & # 181L ماء منزوع الأيونات إلى الأنبوب الشفاف الذي يحتوي على المخزون الموفر من الشركة المصنعة. من المهم تجنب إدخال الفقاعات في المحلول عن طريق خلط المحلول بالمص البطيء واللطيف.
            2. أضف 20 & # 181L 10X عينة المخزن المؤقت و 20 & # 181L من محلول DTT 400 ملي مولار إلى الأنبوب الوردي الذي يحتوي على مزيج رئيسي 5X الفلورسنت (انظر جدول المواد).
              ملاحظة: يتم ختم Master Mix (MM) من قبل الشركة المصنعة بغطاء رقائق ويجب أن يكون مثقوبًا بطرف ماصة. تخلط بلطف عن طريق الماصات البطيئة لتجنب تناثر DTT في الماصة.
            3. بعد ذلك ، أضف 16 & # 181L ماء منزوع الأيونات ، و 2 & # 181L من المخزن المؤقت لعينة 10x المزودة ، و 2 & # 181L من محلول DTT المحضر 400 ملي مولار إلى أنبوب السلم الأبيض المعالج بالبيوتين الذي توفره الشركة المصنعة. مزيج بلطف ونقل إلى أنبوب 0.6 مل لتغيير طبيعة.
            4. تحضير 0.1x عينة المخزن المؤقت عن طريق تخفيف الحل 10x المزود 1: 100 بالماء. إعداد ما يكفي من المخزن المؤقت 0.1x عينة لتخفيف جميع العينات.
            5. احسب مقدار عازلة 0.1x للعينة التي تمت إضافتها إلى عينة ، والتي ستعتمد على التركيز النهائي المطلوب للبروتين الكلي. مزيج 1 جزء 5x مم الفلورسنت مع 4 أجزاء عينة مخففة لتحقيق تركيز البروتين النهائي المطلوب.
              1. احسب الأحجام على النحو التالي: (1) الحجم 5x فلورسنت MM = (تركيز البروتين النهائي المطلوب) / 5 (2) حجم مخزون البروتين = (تركيز البروتين النهائي المطلوب × إجمالي الحجم المطلوب) / تركيز مخزون البروتين (3) الحجم 0.1x العينة المخزن المؤقت = الحجم الإجمالي - حجم 5x & # 160 ملم - حجم مخزون البروتين.

              2. تمسخ العينات والسلم

                ضع العينات المحضرة والسلم المعالج بالبيوتينيلات في كتلة حرارية 95 & # 176 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أنابيب دوامة مباشرة بعد الحضانة ، قم بتنفيذ دوران ل

              3. تحضير الأجسام المضادة

              1. على النحو الذي تحدده التحسين (انظر نتائج الممثل و فيديو) ، قم بإعداد التخفيف (التخفيضات) المطلوب من الجسم المضاد الأولي (على سبيل المثال، 1:50 ، 1: 100) في مخفف الجسم المضاد المقدم 2.
                ملاحظة: تستخدم الأجسام المضادة عمومًا بتركيزات أعلى للمقايسة المناعية القائمة على الشعيرات الدموية مقارنة بالنشاف الغربي التقليدي. يكون الجسم المضاد الثانوي المزود جاهزًا للاستخدام دون تخفيف.

              4. تحضير Luminol-S و Peroxide

              1. تحضير خليط 1: 1 من luminol-S و peroxide.
              2. دوامة للخلط والتخزين على الجليد.
                ملاحظة: من المهم أن يتم تحضير هذا الخليط طازجًا لكل مقايسة تجريبية. هناك حاجة إلى 250ul مزيج إجمالي لتشغيل لوحة كاملة.

              5. إعداد لوحة الفحص

              1. كما هو موضح في شكل 1، قم بتحميل العينات والكواشف المحضرة أعلاه في لوحة الفحص. انظر التعليمات التفصيلية أدناه لكل صف. لتقليل التبخر من الآبار ، تأكد من استبدال غطاء اللوحة بين إضافات الكاشف.
              2. في الصف A ، الماصة 5 & # 181L من سلم Biotinylated إلى البئر A1. بالنسبة للصف المتبقي ، أعدت الماصة عينات (5 & # 181 لتر لكل منهما) في الآبار A2-A25.
                ملاحظة: من الضروري أن يحتوي البئر A1 دائمًا على سلم ، حيث تم تحسين الشعيرات الدموية الأولى في الخرطوشة لتشغيل هذا المعيار.
              3. في الصف B ، الماصة 10 & # 181L من مخفف الجسم المضاد 2 في كل بئر (B1-B25).
              4. في الصف C ، الماصة 10 & # 181L من الجسم المضاد المخفف 2 في البئر C1. في الآبار C المتبقية الصف ، الماصة 10 & # 181L من الأجسام المضادة الأولية (الآبار C2-C25).
              5. في الصف D ، الماصة 10 & # 181L من Streptavidin-HRP في البئر D1. في الصف المتبقي من الآبار D ، الماصة 10 & # 181L من الأجسام المضادة الثانوية (الآبار D2-D25).
              6. في الصف E ، الماصة 10 & # 181 لتر من مزيج لومينول بيروكسيد الطازج في كل بئر (E1-E25).
              7. أخيرًا ، أضف 500 & # 181L عازلة غسيل لكل حجرة إلى كل من الصفوف الثلاثة العلوية من الآبار العازلة.
                ملاحظة: من المهم تقليل تكوين الفقاعات عن طريق الأنابيب برفق وعدم طرد الحجم النهائي من الحافة حيث قد تتداخل الفقاعات مع التحميل الشعري وتشغيلها.
              8. بمجرد تحميل جميع الآبار ، قم بالطرد المركزي في اللوحة


              شكل 1. قالب سحب العينات للوحة الفحص. يمثل الترميز اللوني الكواشف والعينات المناسبة (حتى إجمالي 24) المضافة إلى لوحة الفحص. أضف سلمًا معالجًا بالبيوتينلات إلى البئر A1 (برتقالي) ، عينات محضرة من الآبار A2 حتى A25 (أزرق فاتح) ، مضاد للجسم المضاد 2 إلى الآبار B1-B25 و C1 (أخضر فاتح) ، جسم مضاد أولي للآبار C2 حتى C25 (أزرق) ، streptavidin-HRP إلى البئر D1 (وردي غامق) ، والأجسام المضادة الثانوية للآبار D2 حتى D25 (أخضر داكن) ، ومزيج luminol-peroxide إلى الآبار E1 حتى E25 (أرجواني). يضاف المخزن المؤقت للغسيل إلى الصفوف الثلاثة الأولى من آبار منتصف اللوحة الأكبر (الأزرق الداكن). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

              6. بدء تشغيل أداة المقايسة المناعية الشعرية

              1. تأكد من تشغيل الجهاز والكمبيوتر المصاحب. لا حاجة لوقت الاحماء.
              2. افتح برنامج الأجهزة على الكمبيوتر. أولاً ، حدد علامة التبويب & # 34Assay & # 34 على يمين النافذة و & # 34 New Assay & # 34 ضمن & # 34 قائمة الملفات & # 34 على اليسار. حدد الحجم ، نطاق الحجم (على سبيل المثال، 12-230 كيلو دالتون) ، ونوع الخرطوشة (على سبيل المثال، 25 شعريًا) تم استخدامه للمقايسة المعينة.
                ملاحظة: يمكن للمرء أيضًا إدخال معلمات الفحص ، بما في ذلك تركيز البروتين ونوع الجسم المضاد والتخفيف ، إذا رغبت في ذلك ، ولكن هذه ليست مطلوبة لبدء الفحص.
              3. افتح باب الجهاز بالضغط على الزر الموجود أعلى اللوحة البرتقالية.
              4. قم بإزالة خرطوشة الشعيرات الدموية بعناية من عبوتها. ضع الخرطوشة في حامل الخرطوشة بدون لمس الشعيرات الدموية الزجاجية نفسها. تحقق من مكان جلوس الخرطوشة من خلال ملاحظة تغيير الضوء الداخلي من البرتقالي إلى الأزرق.
              5. امسك اللوح بإحكام على المقعد وقم بإزالة ختم التبخر بعناية من الجزء السفلي من اللوحة. فرقع أي فقاعات تظهر في آبار مصفوفة الفصل هذه برأس ماصة صغيرة أو إبرة نظيفة (على سبيل المثال، 25 مقياس معقم & # 34rep أعلى & # 34 إبرة).
              6. ضع لوحة الفحص على حامل اللوحة ، وتأكد من أنها مثبتة بالكامل ، وأغلق باب الجهاز.
              7. انقر فوق الزر & # 34Start & # 34 في البرنامج.
                ملاحظة: إذا لم يظهر زر Start (ابدأ) ، فهذا يعني أن الاتصال بالجهاز قد فقد. اختر أداة من القائمة العلوية اليسرى ، ثم اختر اتصال. يجب أن تظهر نافذة منبثقة تحتوي على الرقم التسلسلي للأداة ، حدد هذا ، ثم انقر فوق اتصال. يجب أن يظهر زر البدء الآن.
              8. عند اكتمال التشغيل ، تخلص من اللوحة. قم بإزالة الخرطوشة ووضعها في حاوية الأدوات الحادة للتخلص منها ، جنبًا إلى جنب مع أي إبر قد تكون قد تم استخدامها لفرقعة الفقاعات. اترك الطاقة قيد التشغيل لتجنب مشاكل الاتصال إذا تم استخدام الجهاز بانتظام (على سبيل المثال، أسبوعيًا على الأقل).
              1. قبل التحليل ، تأكد من إجراء فحوصات الجودة التالية.
                1. تحقق من معايير الفلورسنت عن طريق تحديد أيقونة & # 34Show Standards & # 34. تحقق من تحديد المعايير بشكل صحيح في علامة التبويب & # 34Graph View & # 34. إذا كانت غير صحيحة ، فانتقل إلى أيقونة & # 34Single View & # 34 ، وانقر بزر الماوس الأيمن على الذروة الصحيحة ، وحدد & # 34Force Standard & # 34 ، أو انقر بزر الماوس الأيمن على الذروة غير الصحيحة وحدد & # 34Not a Standard & # 34. قم بإجراء هذا الفحص لكل أنبوب شعري جديد.
                2. تحقق من السلم الحيوي من خلال النقر على أيقونات & # 34Samples & # 34 و & # 34Single View & # 34. حدد السلم في علامة التبويب التجربة. إذا تم تحديد ذروة بشكل غير صحيح ، فانقر بزر الماوس الأيمن عليها في & # 34Graph View & # 34 وحدد & # 34Remove Peak & # 34.
                  ملحوظة: على سبيل المثال ، يجب أن يُظهر السلم المعزز حيوياً المستخدم لمجموعة 12 - 230 كيلو دالتون قمم قياس 12 و 40 و 66 و 116 و 180 و 230 كيلو دالتون & # 160. إذا لم يتم تنفيذ هذه الخطوة ، فسيتم حساب حجم قمم العينة بشكل غير صحيح ، مما ينتج عنه نتائج زائفة.
                3. عرض وتحليل نماذج القمم. اشتق البيانات من جدول القمم ، بما في ذلك الوزن الجزيئي ومنطقة الذروة وارتفاع الذروة والإشارة إلى الضوضاء (S / N) ، حسب الحاجة للحسابات التجريبية.

                نتائج الممثل

                زمن التعرض - تحديد نضوب الإشارة

                يمكن أن يحدث نضوب الإشارة عندما يتم استنفاد ركيزة اللومينول والبيروكسيد بسرعة كبيرة. يمكن تحديد ذلك من خلال فحص البيانات في أوقات التعرض المختلفة للتلألؤ الكيميائي. في برنامج التحليل ، انتقل إلى & # 34Edit - & # 62 Analysis - & # 62 Images & # 34. تتراوح التعريضات من 5 إلى 480 ثانية. يُبلغ المحور الصادي في مخطط الرسم الكهربائي عن الإشارة / الوقت ، لذلك يجب أن تحتوي البيانات من كل تعرض على إشارة / معامل وقت مماثل. يتناقص هذا المعامل مع التعرض الأطول بالتتابع إذا استنفد luminol ، كما يتضح من الجسم المضاد p53 DO-1 (الشكل 2). بسبب استنفاد الركيزة ، يمكن اعتبار هذا الاختبار قابلاً للقياس حتى تركيز 0.2 & # 181g / & # 181L فقط عند التعرض 5-30 ثانية. لذلك ، في هذا المثال ، تم تحديد 15 ثانية ليكون وقت التعرض الأمثل لتحليل البيانات لـ p53.

                معايرة المحللة - تحديد المدى الديناميكي الخطي

                من المهم أن تؤخذ القياسات ضمن النطاق الديناميكي الخطي لكل مقايسة ، حيث تتناسب التغييرات في الإشارة المقاسة بمنطقة الذروة مع التغيرات في كمية البروتين في العينة. باستخدام وقت التعرض الأمثل الذي يبلغ 15 ثانية المختار في القسم السابق ، يتم توضيح الخطية للمقايسة لكل من p53 و & # 593-tubulin على مدى أكبر من نطاق تركيز 15 ضعفًا (الشكل 3). في تجربتنا ، تعتبر قيمة R 2 لـ & # 620.9 لتوافق الانحدار الخطي مقبولة لنطاق تخفيف من البروتين المنقى بكمية معروفة (إذا كان الفحص قياسًا كميًا مطلقًا) أو محللة عينة من بروتين مستهدف غير معروف (إذا كان الفحص هو القياس الكمي المطلق) قياس كمي نسبي).

                تحسين تخفيف الجسم المضاد

                يساعد استخدام الأجسام المضادة بتركيزات التشبع على ضمان أن أي تغيرات في الإشارة المقاسة ترجع فقط إلى التغيرات في كمية البروتين. كتوضيح ، تم فحص مستخلصين خلية كاملة من خط خلية BEAS-2B (0.2 & # 181 جم / & # 181 لتر بروتين إجمالي محمل في الفحص) بتركيزات من الأجسام المضادة المخففة بالتسلسل & # 593-tubulin تتراوح من 1:25 - 1: 800 (الشكل 4). تم رسم إشارة مضيئة كيميائي (هنا ، تقاس كمنطقة ذروة) ضد تخفيف الجسم المضاد. لوحظ التشبع بالقرب من التخفيف 1:50 حيث يبدأ المنحنى في هضبة ملحوظة.

                تجربة تجريبية - علاج دوكسوروبيسين في خلايا BEAS-2B

                باستخدام شروط الفحص المحسّنة ، تمت معالجة زراعة الخلايا BEAS-2B بثلاثة تركيزات مختلفة من دوكسوروبيسين (1.2 ، 1.8 ، و 2.4 & # 181 جم / مل) لمدة 4 ساعات (الشكل 5, الجدول 1). يتوسط تنشيط p53 من خلال التعديلات اللاحقة للترجمة العديد من الاستجابات الخلوية ، بما في ذلك توقف دورة الخلية ، والشيخوخة ، وموت الخلايا المبرمج 12. على وجه التحديد ، يُعزى فسفرة السيرين 15 إلى التنشيط النسخي لـ p53 ، مما أدى إلى موت الخلايا المبرمج بعد علاج دوكسوروبيسين. في هذا العرض التوضيحي ، يتم تقديم & # 593-tubulin الطبيعي مناطق الذروة كطيبة تحكم. ومن المثير للاهتمام ، أن 3.5 إلى 4 أضعاف الزيادات في فسفرة p53 عند سيرين 15 وزيادات مرتين في مستوى p53 الفسفرة في سيرين 20 لوحظت بعد 4 ساعات من التعرض لدوكسوروبيسين. تشير هذه النتائج إلى تنشيط p53 ، ومع ذلك ، لا توجد استجابة للجرعة للتركيزات المختارة (على العكس من ذلك ، فإن أقل جرعة تم اختبارها هي التي أثارت أعلى استجابة). لم يُظهر إجمالي p53 استجابة علاجية واضحة في هذا النظام النموذجي. لقد لاحظنا سابقًا تنشيط الفسفرة p53 في حالة عدم وجود مستويات متزايدة من إجمالي p53 في ظل ظروف مماثلة في خلايا BEAS-2B المعالجة بالزنك 14.


                الشكل 2. مقارنة صورة التعرض لاكتشاف نضوب الإشارة. تُظهر مناظر الممر تناقصًا في تركيزات البروتين لمحللات BEAS-2B التي تم فحصها باستخدام الجسم المضاد p53 DO-1 بتخفيف 1: 500. يتم فرض معاملات إشارة اللمعان الكيميائي ، التي تم الإبلاغ عنها على أنها ارتفاعات الذروة في برنامج الجهاز. على عكس ارتفاعات الذروة ، يتم إنشاء وضبط شدة النطاق المرئي تلقائيًا بواسطة الأداة للمساعدة في عرض النطاقات ولا يمكن مقارنتها من لوحة إلى أخرى. لاحظ انخفاض إشارة اللمعان الكيميائي مع زيادة وقت التعرض ، مع بدء الإشارة بالاختفاء (ذروة الانقسام) عند أطول تعريضتين ، مما يشير إلى نضوب الركيزة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.


                الشكل 3. معايرة Lysate تظهر وجهات نظر الممر. معايرة Lysate تظهر وجهات نظر الممر (أ) من محلول BEAS-2B عند فحصه باستخدام 1: 500 p53 DO-1 أو 1:50 & # 593-tubulin. على عكس قيم منطقة الذروة ، يتم إنشاء شدة النطاق المرئي وتعديلها تلقائيًا بواسطة الأداة للمساعدة في عرض النطاقات ولا يمكن مقارنتها من لوحة إلى أخرى. & # 160 تحليل الانحدار الخطي (ب) يؤكد أن المقايسات خطية على النطاق الكامل الذي تم اختباره ، من 0.01 إلى 0.20 & # 181g / & # 181L و 0.025 إلى 0.40 & # 181g / & # 181L ، بقيم R 2 تبلغ 0.999 و 0.985 ، على التوالي. تم اختيار تركيزات البروتين الكلية في منتصف النطاق الخطي لاستيعاب تباين البروتين المستهدف المحتمل في أي من الاتجاهين (على سبيل المثال، 0.2 & # 181g / & # 181L for & # 945-tubulin). & # 160 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.


                الشكل 4. & # 945-منحنيات تخفيف الجسم المضاد لتوبيولين لاثنين من محللات البروتين المنفصلة BEAS-2B مع وبدون تطبيع خط الأساس. شوهد خروج محدد عن الخطية عند التخفيف 1:50 (0.02) ، مما يشير إلى التشبع. لذلك تم اختيار 1:50 على أنه التخفيف الأمثل لهذا الجسم المضاد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.


                الشكل 5.تأثير علاج 4 ساعات دوكسوروبيسين (DXN) على التعبير الكلي والبروتيني p53 الفسفوري لخلايا BEAS-2B. يتم تطبيع مناطق الذروة إلى & # 945-tubulin ويتم رسمها على أنها طية تحكم (CTL). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.


                الجدول 1. تأثير العلاج 4 ساعات دوكسوروبيسين (DXN) على التعبير الكلي والبروتين p53 الفسفوري للسيرين لخلايا BEAS-2B. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

                مناقشة

                لعقود من الزمان ، كان هناك اهتمام مستمر بتطوير طرق المقايسة المناعية القائمة على الكهربي الشعري بسبب انخفاض نفقات العينة والكاشف ، وانخفاض وقت المعالجة مقارنة بالطرق التقليدية ، والتوافق العالي لأتمتة الإجراء 4 ، 15. هناك عدد من البروتوكولات المختلفة لفصل البروتينات التي استخدمت الشعيرات الدموية ، بما في ذلك الطرق الكهربية ، والحركية الكهربية ، ونخل البوليمر ، والطرق الكهربية المتساوية ، والتي تعزل البروتينات بخصائص مختلفة (على التوالي ، الشحنة الكهروستاتيكية ، وتوازن التقسيم ، وخصائص الغربلة لمصفوفة الفصل ، ودرجة الحموضة) 16. هنا ، نصف طريقة الرحلان الكهربي الشعري المعتمد على الجسم المضاد (أو المقايسة المناعية) ، باستخدام فصل غربلة البوليمر ، والتي تم تشغيلها آليًا واعتمادها تجاريًا 3. تشمل مزايا هذا النظام سهولة الاستخدام والتشغيل ، والكواشف المعيارية والمتاحة تجاريًا ، والقياسات الموثوقة والحساسة التي تتطلب كواشف وعينات أقل مقارنة بمقايسات البروتين التقليدية مثل اللطخة الغربية ، والمقايسة المناعية المرتبطة بالإنزيم ، وغيرها من الأشكال 3 ، 4 ، 5. لقد لوحظ في التقييمات السابقة لهذه التكنولوجيا أن نطاق حجم البروتين الذي يمكن تقييمه كان محدودًا بمصفوفة الفصل المتاحة 4 ، ومع ذلك فقد وسعت العروض الحديثة النطاق القابل للقياس من 2 إلى 440 كيلو دالتون 17. بالإضافة إلى ذلك ، من المعروف أن بعض المخازن المؤقتة المحللة غير متوافقة مع المقايسة 18 ، لذلك يجب النظر مسبقًا في اختيار الكواشف التجريبية المستخدمة.

                الميزة الرئيسية للإجراء الآلي مع المكونات المتاحة تجاريًا هي اتساق النتائج من خلال الطرق القياسية والكواشف. هذا يقلل من فرص فشل الاختبار عن طريق أتمتة الخطوات الحاسمة في الإجراء. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أنه يجب الالتزام ببعض الممارسات أثناء البروتوكول لتقليل المشكلات المتعلقة بالمقايسة المناعية القائمة على الشعيرات الدموية. أولاً ، من الأهمية بمكان تحضير خليط luminol-S / peroxide طازجًا وقبل تحميل اللوحة مباشرةً. سيؤدي التوقيت المتسق إلى تلألؤ متسق بعد إضافة العامل المؤكسد ، والذي سينتج عنه قياسات متسقة لفحص جسم مضاد معين بعد الفحص. علاوة على ذلك ، من المهم استخدام الكواشف غير منتهية الصلاحية ، والتي تؤثر بشكل أساسي على فاعلية العامل المؤكسد. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم اتباع ترتيب تحميل العينات والأجسام المضادة والكواشف الأخرى بدقة (انظر شكل 1). أي كاشف ماص في غير مكانه سينتج عنه فشل في الفحص وضياع التشغيل.

                إلى جانب هذه الخطوات الحاسمة ، يمكن بشكل عام التغلب على المشكلات الأساسية التي تمت مواجهتها مع هذه التقنية من خلال التحسين. في الواقع ، هذه الشروط خاصة بكل نظام نموذجي / تركيبة جسم مضاد ، وبالتالي يجب تحديدها تجريبياً لكل مقايسة جديدة. في هذه المقالة ، نركز على ثلاثة إجراءات تحسين شائعة: وقت التعرض ، ومعايرة المحللة ، وتخفيف الجسم المضاد الأولي. تعتمد القدرة على توليد نتائج قابلة للقياس على تحليل وقت التعرض عندما لا يتم استنفاد ركيزة اللومينول بسرعة ، حيث يؤدي استنفاد الركيزة إلى فقدان الإشارة. تحدد معايرة Lysate النطاق الديناميكي الخطي لكل اختبار ، والذي يمكن أن يختلف باختلاف أنظمة النماذج ، وكذلك الأجسام المضادة المختلفة ، حتى لنفس هدف البروتين. تضمن تخفيفات الجسم المضاد المختارة بتركيزات التشبع أو بالقرب منها أن التغييرات في الإشارة لن تتأثر بنقص الأجسام المضادة الحرة ، ولكن فقط بكمية مختلفة من حاتمة البروتين المستهدفة المتاحة. قد تشمل الاعتبارات الأخرى أثناء عملية التحسين وقت حضانة الجسم المضاد وتكديس / وقت تحميل العينة. في معظم الحالات ، توفر الإعدادات الافتراضية للأداة أفضل توازن بين الدقة والحساسية. ومع ذلك ، في بعض الحالات ، يمكن تحسين الدقة أو الحساسية الضعيفة عن طريق ضبط هذه المعلمات.

                توفر طرق المقايسة المناعية القائمة على الرحلان الكهربي الشعري قياسات بروتينية سريعة وفعالة وقابلة للتكاثر. بينما تم استخدام هذه الأساليب في المقام الأول في إعدادات البحث والتطوير ، فإن اتساق هذه التقنيات له فائدة محتملة في التطبيقات التنظيمية والسريرية. على سبيل المثال ، يمكن أن يعتمد تحديد المجموعات السكانية الفرعية المعرضة للسموم البيئية أو المرضى الذين يعانون من تطور المرض على المؤشرات الحيوية للبروتين المقاسة في المصفوفات التي يمكن الوصول إليها ، مثل الدم والبول واللعاب. مع انخفاض تكاليف الكواشف والتشغيل وزيادة عدد العينات والأهداف التي يمكن تقييمها في وقت واحد ، من المحتمل أن نرى طرق المقايسة المناعية القائمة على الكهربي الشعري المستخدمة في هذه الأنواع من التطبيقات.

                الإفصاحات

                يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة. تمت مراجعة هذه المخطوطة من قبل المختبر الوطني لبحوث الآثار الصحية والبيئية وتمت الموافقة على نشرها. لا يعكس المحتوى بالضرورة وجهات نظر وكالة حماية البيئة الأمريكية ولا يمثل ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية تأييدًا أو توصية للاستخدام.

                شكر وتقدير

                يود المؤلفون أن يشكروا كيث تاربلي من مكتب وكالة حماية البيئة الأمريكية للبحوث والتطوير - فريق البحث في الجرافيك والإعلام (ORD-RTP) على تطوير الفيديو التعليمي وتسجيله وتحريره. نود أيضًا أن نشكر Deborah Pritchett من ProteinSimple على المحادثات المفيدة المتعلقة بتحسين بياناتنا. تم دعم JM Guynn من قبل معهد أوك ريدج لبحوث العلوم والتعليم / برنامج المشاركة في وكالة حماية البيئة الأمريكية.


                نقاش

                يعد النقل النشط لأيونات Na + و K + عبر غشاء البلازما ، وهي مهمة مهمة تؤديها مضخة Na + / K + ، ضرورية للحفاظ على إمكانات استراحة الغشاء وتنظيم النشاط الكهربائي للخلايا العصبية (Therien و Blostein ، 2000). ومن ثم ، فإن التغيير في التيار الناتج عن مضخة Na + / K + يؤثر على الخصائص الفسيولوجية للخلايا العصبية. تتماشى هذه الدراسة مع تحقيقاتنا السابقة حول تأثير 10 mT SMF على نشاط مضخة Na + / K + (Nikolić et al. ، 2012) وتوضح كذلك أن تعبير مضخة Na + / K + في غشاء البلازما يتم تغيير المنطقة وكثافة تيار المضخة بعد تعرض الخلايا العصبية الحلزونية إلى 10 mT SMF.

                يتم تحقيق التنظيم قصير المدى لنشاط مضخة Na + / K + عن طريق الفسفرة وإزالة الفسفرة عن طريق تغيير الخصائص الوظيفية (مثل معدل الدوران) للمضخات الموجودة بالفعل في غشاء البلازما ، وكذلك عن طريق تعديل مضخة Na + / K + التعبير على سطح الخلية (Therien and Blostein ، 2000). يتم تحقيق هذا الأخير عن طريق تجنيد تجمع بروتين داخل الخلايا للمضخة إلى غشاء البلازما ، وعن طريق استيعاب البركة المرتبطة بغشاء البلازما (Barlet-Bas et al.، 1990 Chibalin et al.، 1999 Gonin et al.، 2001 Budu et al.، 2002 Efendiev et al.، 2003 Vinciguerra et al.، 2003 Efendiev et al.، 2007). تشير نتائجنا السابقة (Nikolić et al. ، 2012) والنتائج التي تم الحصول عليها في الدراسة الحالية إلى أن الزيادة التي يسببها SMF في نشاط مضخة Na + / K + يمكن التوسط فيها من خلال آليات قصيرة المدى لتنظيم نشاط المضخة. تشير نتائجنا إلى أن SMF قد عمل على إعادة توزيع مضخة Na + / K + من المقصورات داخل الخلايا باتجاه غشاء البلازما ، حيث زاد التعبير عن الوحدة الفرعية لمضخة Na + / K + بشكل ملحوظ في منطقة غشاء البلازما بينما أظهر اتجاهًا نحو انخفاض في السيتوبلازم. استنادًا إلى النتائج السابقة التي توصلنا إليها (Nikolić et al. ، 2012) ، يمكن التوسط في مثل هذا التأثير لـ SMF عن طريق مسارات إشارات الفسفرة وإزالة الفسفرة التي تنظم التعبير عن مضخة Na + / K في غشاء البلازما. في الواقع ، تشير بياناتنا إلى أن زيادة بنسبة 13٪ في التعبير عن الوحدة الفرعية α لمضخة Na + / K + في غشاء البلازما لا يمكن أن تكون مسؤولة فقط عن زيادة 57٪ في كثافة تيار المضخة Na + / K + التي لوحظت بعد تعرض SMF 10 mT. وبالتالي يمكن أن يُعزى هذا التناقض إلى عمليات الفسفرة المذكورة أعلاه وعمليات نزع الفسفرة (Nikolić et al. ، 2012) التي أثرت بشكل مباشر على نشاط المضخات الموجودة بالفعل في غشاء البلازما. أظهرت البيانات السابقة أن التعرض لمدة 15 دقيقة للـ SMF المعتدل متبوعًا بالشفاء لمدة 30 دقيقة ويوم واحد تسبب في حدوث تغييرات بارزة في التعبير عن الجينات المشاركة في التمثيل الغذائي الخلوي في خط الخلايا الجنينية البشرية وخلايا الفئران العصبية المستزرعة في الحصين ، على التوالي (Hirai et al. ، 2002 وانج وآخرون ، 2009). في تجاربنا ، لم يتغير التعبير العام للوحدة الفرعية α لمضخة Na + / K + بشكل ملحوظ بعد 15 دقيقة من التعرض لـ 10 mT SMF. يمكن توقع هذه النتائج ، حيث تم تحليل تعبير الوحدة الفرعية α لمضخة Na + / K + في دراستنا فورًا بعد توقف التعرض لمدة 15 دقيقة لـ 10 mT SMF.

                تم وصف توزيع الوحدة الفرعية α لمضخة Na + / K + في منطقة غشاء البلازما بالإضافة إلى كثافة تيار المضخة في الخلايا العصبية المعرضة لـ 10 mT SMF مع ملاءمة Gaussian الفردية. في المقارنة ، كان هناك حاجة إلى مجموع نوبات غاوسية لوصف توزيع الوحدة الفرعية لمضخة α Na + / K + في منطقة غشاء البلازما وضخ كثافة التيار في الخلايا العصبية الضابطة ، مما يشير إلى أن مجموعة الخلايا العصبية الضابطة تتكون من اثنين مجموعات. وبالتالي ، فإن الزيادة التي يسببها SMF في التعبير عن الوحدة الفرعية لمضخة Na + / K + في منطقة غشاء البلازما والزيادة في التيارات المرتبطة بالمضخة تسببت في أن يصبح تعداد الخلايا العصبية متجانسة. بالمقارنة مع بيانات التألق المناعي ، كانت مجموعتا العصبونات الضابطة يمكن تمييزهما بوضوح على المستوى الفيزيولوجي الكهربائي. يمكن أن تُعزى القدرة على التمييز الواضح بين مجموعات الخلايا العصبية الضابطة بناءً على كثافة تيار المضخة Na + / K + إلى عمليات الفسفرة وإزالة الفسفرة التي تنظم الخصائص الوظيفية للمضخات الموجودة بالفعل في غشاء البلازما. علاوة على ذلك ، يمكن القول أن الخلايا العصبية الضابطة لها تركيبات مختلفة من الأشكال الإسوية للوحدة الفرعية α- لمضخة Na + / K +. تتميز الأشكال الإسوية للوحدة الفرعية α اللافقارية والفقارية بخصائص متشابهة وهي أن الأشكال الإسوية للوحدة الفرعية α تختلف في حساسيتها تجاه مثبطات مضخة Na + / K + وتركيزات أيونات Na + و K + (Cortas et al. ، 1989 Blanco وميرسر ، 1998). على الرغم من عدم وجود معرفة مفصلة عن الأشكال الإسوية للوحدة الفرعية لمضخة Na + / K + في الجهاز العصبي الحلزون ، بناءً على البيانات الموجودة (Cortas et al. ، 1989 Blanco and Mercer ، 1998) ، سيكون من المعقول افتراض ذلك تعبر الخلايا العصبية الحلزونية عن الأشكال الإسوية للوحدة الفرعية α- لمضخة Na + / K + والتي لها بعض أوجه التشابه مع الأشكال الإسوية للوحدة الفرعية α في الخلايا العصبية للثدييات. لقد ثبت أن الخلايا العصبية للثدييات تعبر عن الأشكال الإسوية α1 و α3 للوحدة الفرعية التحفيزية لمضخة Na + / K + (Hieber et al. ، 1991 Watts et al. ، 1991 Pietrini et al. ، 1992 Brines and Robbins ، 1993). علاوة على ذلك ، كشفت الأبحاث السابقة عن تجميع أنواع مختلفة وحتى أنواع فرعية من الخلايا العصبية في الثدييات بناءً على كثافة المضخة الحالية لـ Na + / K + (Dobretsov et al. ، 1999a Anderson et al. ، 2010). تتفق بياناتنا مع تلك النتائج حيث حددنا مجموعتين من الخلايا العصبية الحلزونية (C1 و C2) متمايزة حسب مستوى الاستجابة لأوابين. ومع ذلك ، فإن ارتباط الاستجابات من المجموعات العصبية C1 و C2 المعينة بشكل تعسفي مع النوع العصبي المحدد يحتاج إلى مزيد من الدراسة الفيزيولوجية الكهربية. علاوة على ذلك ، كشفت نتائجنا أن المجموعات العصبية C1 و C2 استجابت بشكل مختلف لـ SMF 10 mT المطبقة ، حيث كانت الزيادة المستحثة في كثافة Na + / K + مهمة فقط في مجموعة الخلايا العصبية C1. ومع ذلك ، كان التأثير الكلي لـ SMF زيادة كبيرة في كثافة تيار المضخة Na + / K + في إجمالي عدد الخلايا العصبية التي تم فحصها (C1 مع C2). لم نتمكن من ملاحظة أي اختلافات في مقاومة الغشاء وحجم الخلايا العصبية بين مجموعتي C1 و C2 من الخلايا العصبية. علاوة على ذلك ، لم تسمح لنا البيانات التي تم الحصول عليها بتحديد مجموعات C1 و C2 على أنها خلايا عصبية لنشاط كهربائي حيوي معين ووظيفة في الجهاز العصبي الحلزون. في هذه الدراسة ، قمنا بفحص تعبير Na + / K + لمضخة α1 ، والذي ثبت أنه شكل إسوي مهيمن في الجهاز العصبي المركزي للجرذان (Watts et al. ، 1991). ومع ذلك ، أظهرت البيانات السابقة أيضًا أن الخلايا العصبية في الثدييات التي تعبر عن الشكل الإسوي α1 تعبر أيضًا عن الشكل الإسوي لمضخة α3 Na + / K + في غشاء البلازما (Dobretsov et al. ، 1999b Matsumoto et al. ، 2011). لذلك ، نقترح أن الاستجابات المنفصلة بوضوح للخلايا العصبية الحلزونية C1 و C2 إلى ouabain مرتبطة بالأشكال الإسوية للوحدة الفرعية α / المضخة المشتركة معًا بنسب مختلفة في غشاء البلازما لهذه الخلايا العصبية. وبالتالي ، من الممكن التكهن بأن الحساسية المختلفة للمجموعات العصبية C1 و C2 إلى 10 mT SMF قد تكون مرتبطة بشكل إسوي معين لمضخة Na + / K +. يمكن دعم هذا الافتراض من خلال إجراء مزيد من التحقيق في التعبير عن الأشكال الإسوية للوحدة الفرعية α للوحدة الفرعية Na + / K + في الخلايا العصبية الحلزونية.

                التأثيرات التفاضلية لـ 10 mT SMF على كثافة المضخة الحالية Na + / K + في الخلايا العصبية الحلزونية المعزولة. (أ) اللوحة اليسرى: آثار تمثيلية لتسجيلات المشبك ذات الجهد الكامل للخلية من الخلايا العصبية للتحكم بنفس الحجم تقريبًا (سعة الغشاء جم≈45 pF) تظهر الاستجابات الحالية المتغيرة الحساسة للداخل لتطبيق 100 ميكرولتر لتر −1 ouabain (شريط أسود ، OB). القدرة القابضة ، −50 mV. اللوحة اليمنى: أفضل ما يناسب الكثافة الحالية لمضخة Na + / K + لعصبونات التحكم هو مجموع توزيعي Gaussian (ر 2 = 0.81). لاحظ أنه يتم فصل الخلايا العصبية للتحكم بوضوح وفقًا لتيار تثبيط المضخة Na + / K + في مجموعة تظهر كثافة تيار صغيرة (تم تمييزها بشكل تعسفي C1 ، 0.16 ± 0.01 pA pF −1 ، ن= 10) والخلايا العصبية التي تظهر ذروة كثافة تيار كبيرة (تم تمييزها بشكل تعسفي C2 ، 0.28 ± 0.01 pA pF −1 ، ن= 8).(ب) اللوحة اليسرى: تتبع تمثيلي لتسجيلات المشبك ذات الجهد الكامل للخلية للاستجابة الحالية الحساسة لأوابين الناتجة عن تطبيق 100 ميكرولتر لتر −1 ouabain (شريط أسود ، OB) في خلية عصبية تتعرض لـ 10 mT SMF (جم= 25 بيكو فاراد). القدرة القابضة ، −50 mV. اللوحة اليمنى ، Na + / K + كثافة المضخة الحالية للخلايا العصبية المعرضة لـ SMF هي الأفضل من خلال التوزيع الغاوسي الفردي (ر 2 = 0.96). (C) تختلف كثافة تيار المضخة المحسوبة Na + / K + اختلافًا كبيرًا بين الخلايا العصبية للتحكم في C1 (ن= 10) والخلايا العصبية المعرضة للـ SMF (ن= 13) ، وبين الخلايا العصبية C1 والخلايا العصبية C2 (ن=8) (*ص& lt0.05 ، ANOVA في الرتب).

                التأثيرات التفاضلية لـ 10 mT SMF على كثافة المضخة الحالية Na + / K + في الخلايا العصبية الحلزونية المعزولة. (أ) اللوحة اليسرى: آثار تمثيلية لتسجيلات المشبك ذات الجهد الكامل للخلية من الخلايا العصبية للتحكم بنفس الحجم تقريبًا (سعة الغشاء جم≈45 pF) تظهر الاستجابات الحالية المتغيرة الحساسة للداخل لتطبيق 100 ميكرولتر لتر −1 ouabain (شريط أسود ، OB). القدرة القابضة ، −50 mV. اللوحة اليمنى: أفضل ما يناسب الكثافة الحالية لمضخة Na + / K + لعصبونات التحكم هو مجموع توزيعي Gaussian (ر 2 = 0.81). لاحظ أنه يتم فصل الخلايا العصبية للتحكم بوضوح وفقًا لتيار تثبيط المضخة Na + / K + في مجموعة تظهر كثافة تيار صغيرة (تم تمييزها بشكل تعسفي C1 ، 0.16 ± 0.01 pA pF −1 ، ن= 10) والخلايا العصبية التي تظهر ذروة كثافة تيار كبيرة (تم تمييزها بشكل تعسفي C2 ، 0.28 ± 0.01 pA pF −1 ، ن= 8). (ب) اللوحة اليسرى: تتبع تمثيلي لتسجيلات المشبك ذات الجهد الكامل للخلية للاستجابة الحالية الحساسة لأوابين الناتجة عن تطبيق 100 ميكرولتر لتر −1 ouabain (شريط أسود ، OB) في خلية عصبية تتعرض لـ 10 mT SMF (جم= 25 بيكو فاراد). القدرة القابضة ، −50 mV. اللوحة اليمنى ، Na + / K + كثافة المضخة الحالية للخلايا العصبية المعرضة لـ SMF هي الأفضل من خلال التوزيع الغاوسي الفردي (ر 2 = 0.96). (C) تختلف كثافة تيار المضخة المحسوبة Na + / K + اختلافًا كبيرًا بين الخلايا العصبية للتحكم في C1 (ن= 10) والخلايا العصبية المعرضة للـ SMF (ن= 13) ، وبين الخلايا العصبية C1 والخلايا العصبية C2 (ن=8) (*ص& lt0.05 ، ANOVA في الرتب).

                خصائص أغشية الخلايا العصبية التي تتميز بكثافات تيار المضخة المختلفة Na + / K +

                gn3-sxzVZTML8f1BH3eJx29tMlVo0k3xRFeYBqjw __ & ampKey-Pair-Id = APKAIE5G5CRDK6RD3PGA "/>

                يمكن أن يؤدي التغيير في نشاط مضخة Na + / K + إلى تغيير نشاط المبادلات المعتمدة على التدرج Na + والقنوات الأيونية المعتمدة على الجهد وقنوات K + المعتمدة على ATP (Glitsch ، 2001). وجدنا في هذه الدراسة أن التغيير في نشاط مضخة Na + / K + يؤثر على خصائص الغشاء العصبي. بعد تثبيط مضخة Na + / K + مع ouabain ، زادت مقاومة الغشاء في كل مجموعة من الخلايا العصبية التي تم فحصها ، ولكن بشكل ملحوظ في الخلايا العصبية المعرضة لـ C2 و SMF. من المعقول أن التغيير في نشاط مضخة Na + / K + يساهم فقط في التغيير في مقاومة الغشاء للخلايا العصبية الحلزونية ، حيث تكون هذه المساهمة أكثر وضوحًا في الخلايا العصبية المعرضة لـ C2 و SMF مع ارتفاع كثافة تيار المضخة. ومع ذلك ، فإننا نفترض أن التغيير الملحوظ في مقاومة الغشاء يمكن تفسيره على أنه مساهمة لكل من التغيير في نشاط مضخة Na + / K + والتغيير في المواصلات المتأثرة بمضخة Na + / K +. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن حجب مضخة Na + / K + بواسطة ouabain يقلل من التيارات الخارجية في الخلايا العصبية لعقدة الجرذ (Matsumoto et al. ، 2011) والفأر الداخلي الحصين (Richards et al. ، 2007). من المهم الإشارة إلى أن دراسة سابقة أشارت إلى أن تأثيرات SMF المعتدلة على مقاومة الغشاء للخلايا العصبية الحلزونية المحددة يتم توسطها بواسطة الخلايا الدبقية ، حيث أن إزالتها عن طريق علاج دماغ الحلزون بنسبة 1 ٪ من الكبرياز ألغى التأثير الملحوظ (Balaban et al. . ، 1990). ومع ذلك ، في دراستنا ، لا يزال من الممكن ملاحظة حدوث تغيير في مقاومة الغشاء في الخلايا العصبية المعرضة للـ SMF بعد علاج دماغ الحلزون بنسبة 0.5 ٪ من الكبريت. قد يكون التفسير المحتمل للتناقض في تأثيرات SMF المرصودة على مقاومة غشاء الخلايا العصبية الحلزونية هو الاختلاف في تحضير الخلايا العصبية التي تم فحصها. على النقيض من الخلايا العصبية المنفصلة والفردية التي تم فحصها في دراستنا ، قامت الدراسة التي أجراها بالابان وزملاؤه بالتحقيق في تحديد الخلايا العصبية داخل العقد الحلزونية التي حافظت على روابطها المشبكية (Balaban et al. ، 1990). لذلك ، قد يكون من الممكن أن الخلايا العصبية الأخرى من خلال المدخلات المشبكية ، والخلايا الدبقية من خلال التفاعل مع الخلايا العصبية ، تعدل استجابة الخلايا العصبية التي تم فحصها إلى SMF. ومع ذلك ، في دراستنا ، تم استبعاد هذا التفاعل بين الخلايا العصبية. ومع ذلك ، لا يزال يتعين تحديد مساهمة الخلايا الدبقية في تأثيرات SMF على مقاومة غشاء الخلايا العصبية الحلزونية التي لوحظت في دراستنا.

                لا تقدم دراستنا دليلًا على الموقع الخلوي الأساسي لعمل 10 mT SMF. ومع ذلك ، وفقًا للبيانات الواردة في الأدبيات ، يمكن أن يكون التغيير الناجم عن SMF في خصائص القنوات والمضخات الأيونية المضمنة في الغشاء نتيجة لتأثير المجال المغناطيسي على سيولة غشاء البلازما بسبب الخصائص المغناطيسية للطبقة الثنائية الفوسفورية ( Braganza et al.، 1984 Rosen، 2003b Petrov and Martinac، 2007). وهكذا ، فقد ثبت أن خصائص طبقة ثنائية الفسفوليبيد تؤثر على نشاط مضخة Na + / K + (Johannsson et al. ، 1981). علاوة على ذلك ، بالإضافة إلى وظيفة ضخ الأيونات الأساسية ، كشفت الأبحاث الحديثة عن دور إضافي لمضخة Na + / K + في نقل الإشارة في مسارات الإشارات المختلفة (Reinhard et al. ، 2013). من المعقول أن التغيير في نشاط مضخة Na + / K + الناجم عن SMF يؤثر على مسارات تأشير الفسفرة وإزالة الفسفرة. استنادًا إلى أبحاثنا السابقة (Nikolić et al. ، 2012) والحالية ، نقترح أن الزيادة التي يسببها SMF في نشاط مضخة Na + / K يتم توسطها عن طريق مسارات إشارات الفسفرة ونزع الفسفرة التي تنظم التعبير والخصائص الوظيفية لـ المضخة في غشاء البلازما. علاوة على ذلك ، كما يتضح من التغيير في مقاومة الغشاء ، فإن الزيادة التي يسببها SMF في كثافة تيار المضخة Na + / K + أثرت على الأرجح على الموصلية الأيونية المعتمدة على التدرج Na +. وبالتالي ، فإن كل هذه التغييرات التي يسببها SMF ستؤثر بالتأكيد على نمط إطلاق الخلايا العصبية الحلزونية.

                تعتبر تأثيرات SMF المعتدلة التي تم فحصها في دراسات مختلفة مفيدة من الناحية العلاجية على الرغم من أن القوة المناسبة لـ SMF ومدة التعرض لا تزال بحاجة إلى تحديد دقيق. في هذه الدراسة وجدنا أن تعبير مضخة Na + / K + في منطقة غشاء البلازما وكثافة تيار المضخة تتغير بمقدار 10 mT SMF. النتائج التي توصلنا إليها مهمة لأنها تكشف عن الاستجابات الخلوية الناتجة عن SMF التي يمكن مقارنتها في القوة بالمجال المغناطيسي المستخدم للأغراض العلاجية. يتم إبراز أهمية نتائجنا من خلال تقارير عن انخفاض نشاط مضخة Na + / K + لوحظ في العديد من اضطرابات الجهاز العصبي (Lees ، 1991). من خلال مراقبة الزيادة التي يسببها SMF في نشاط مضخة Na + / K + ، قد نبدأ في فهم الآثار المفيدة للحقل المغناطيسي المطبق علاجيًا على الجهاز العصبي ، خاصة وأن مضخات Na + / K + تظهر تشابهًا أساسيًا بين الخلايا العصبية في أنواع حيوانية متنوعة.


                شاهد الفيديو: DEZE STEM KENNEN JULLIE ALLEMAAL!!! #2981 (قد 2022).


تعليقات:

  1. Csaba

    في رأيي ، أنت تعترف بالخطأ. أدخل سنناقش. اكتب لي في PM ، سنتحدث.

  2. Garwyn

    بيننا نتحدث ، في رأيي ، من الواضح. وأنا لن تبدأ في التحدث حول هذا الموضوع.

  3. Donny

    مثير للاهتمام. فقط الاسم تافه إلى حد ما.

  4. Reeya

    واعتقدت أنني كنت أول من قرأ ... (هذا هو الحال دائمًا) يقال جيدًا - موجزة ومريحة للقراءة والإدراك.

  5. Dumuro

    يتفقون معك تماما. في ذلك شيء وإنما هي فكرة ممتازة. أنا أدعمك.

  6. Finbar

    اعلى الذقن

  7. Aldn'd

    أنا آسف ، لكن في رأيي ، أنت مخطئ. اكتب لي في PM.



اكتب رسالة